CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych

Wykonanie ćwiczenia:

Część pierwsza: do 0,5 ml 0,1 % roztworów RNA i DNA dodać kroplami 1M HCl. Następnie dodawać kroplami NaOH. Część druga: do 1 ml 0,1 % roztworów RNA i DNA dodać 2 ml 96% etanolu. W obu przypadkach zanotować obserwacje.

Obserwacje:

- RNA + HCl – powstaje zmętnienie, które znika po dodaniu NaOH

- DNA + HCl – powstaje zmętnienie, które znika po dodaniu NaOH

- RNA + etanol i DNA + etanol – w obu przypadkach pojawia się biały delikatny osad

Wnioski:

Kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, słabo w wodzie, kwasach i alkoholach. W pierwszej części doświadczenia po dodaniu kwasu roztwory w probówkach zrobiły się mętne, co jest oznaką wytrącania się kwasów nukleinowych, gdyż w kwaśnym środowisku maleje ich rozpuszczalność. Dodanie zasady, czyli zobojętnienie środowiska podniosło rozpuszczalność kwasów nukleinowych, dzięki czemu zmętnienie w obu probówkach zanikło. W drugiej części doświadczenia po dodaniu alkoholu do probówek z kwasami nukleinowymi pojawił się osad, co jest spowodowane zmniejszeniem się rozpuszczalności tychże kwasów w obecności alkoholi.

1. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych

Wykonanie ćwiczenia:

2,5 ml 1 % roztworów DNA i RNA zmieszać z 2,5 ml 10 % kwasy siarkowego (VI). Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę.

Wnioski:

Po dodaniu kwasu siarkowego do probówek z kwasami nukleinowymi oraz po inkubacji we wrzącej łaźni wodnej zaobserwowaliśmy brak jakiegokolwiek zmętnienia. Jest to spowodowane rozpadem kwasów nukleinowych na wolne zasady purynowe i nukleotydy pirymidynowe. Dlatego też, pomimo kwaśnego środowiska, nie doszło do zmętnienia roztworów.

1. Wykrywanie pentoz – reakcja orcynolowa

Wykonanie ćwiczenia:

Do każdej z 6 probówek zawierających po 1 ml jednej z określonych substancji (hydrolizaty i 0,1 % roztwory DNA i RNA oraz 1 % roztwory rybozy i deoksyrybozy) dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu dodać po 5 ml wody destylowanej (do rozcieńczenia barwy, niekoniecznie) i określić barwę roztworu.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu RNA – barwa zielona roztworu

- dla hydrolizatu DNA – barwa zielona roztworu

- dla 0,1 % roztworu RNA – barwa zielona roztworu

- dla 0,1 % roztworu DNA – barwa zielona roztworu

- dla 1 % roztworu rybozy – barwa zielona roztworu

- dla 1 % roztworu deoksyrybozy – barwa zielona roztworu

Wnioski:

Pentozy wolne i związane w nukleozydach, ogrzewane w środowisku kwaśnym przechodzą w furfural, który z orcyną i jonami Fe³⁺ dają trwały kompleks o barwie zielonej. Reakcja zaszła we wszystkich trzech próbach potwierdzając obecność w nich pentoz.

1. Wykrywanie pentoz – reakcja Dischego

Wykonanie ćwiczenia:

Do każdej z 6 probówek zawierających po 1 ml jednej z określonych substancji (hydrolizaty i 0,1 % roztwory DNA i RNA oraz 1 % roztwory rybozy i deoksyrybozy) dodać po 2 ml odczynnika difenyloaminowego i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu RNA – bezbarwny, klarowny roztwór

- dla hydrolizatu DNA – barwa niebieska roztworu

- dla 0,1 % roztworu RNA – bezbarwny, klarowny roztwór

- dla 0,1 % roztworu DNA – barwa niebieska roztworu

- dla 1 % roztworu rybozy – bezbarwny, klarowny roztwór

- dla 1 % roztworu deoksyrybozy – barwa niebieska roztworu

Wnioski:

W środowisku kwaśnym deoksyryboza przechodzi w aldehyd hydroksylewulionowy, który następnie kondensuje z difenyloaminą, tworząc niebieski produkt. Jest to reakcja charakterystyczna na wykrycie deoksyrybozy, czyli cukru występującego w DNA i jego hydrolizacie.

1. Wykrywanie kwasu fosforowego

Wykonanie ćwiczenia:

Do 0,5 ml hydrolizatu DNA lub RNA (przeprowadziłem obie reakcje) dodać 3 krople roztworu amoniaku. Następnie dodać 0,5 ml stężonego roztworu HNO₃ i 2 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówki ogrzać do wrzenia.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu DNA – żółty osad, żółta barwa roztworu

- dla hydrolizatu RNA – żółty osad, żółta barwa roztworu, zmętnienie

Wnioski:

Powstanie żółtego osadu świadczy o wytrąceniu się nierozpuszczalnego fosfomolibdenianu amonowego. Potwierdza to obecność kwasu ortofosforowego w próbach.

1. Wykrywanie puryn

Wykonanie ćwiczenia:

Do 1 ml hydrolizatu DNA lub RNA (przeprowadziłem obie reakcje) dodać 6 kropli stężonego roztworu amoniaku i 3 ml amoniakalnego roztworu azotanu srebra.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu DNA – powstał kłaczkowaty biały osad

- dla hydrolizatu RNA – powstał kłaczkowaty biały osad

Wnioski:

Sole zasad purynowych z metalami ciężkimi (np. Ag) w środowisku kwaśnym wytrącają się w postaci krystalicznej. Powstanie osadu w obu probówkach świadczy o obecności puryn w próbach. Powstałym związkiem (osadem) jest sól srebrowa puryny (adeniny lub guaniny).

1. Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną

Wykonanie ćwiczenia:

Do 5 g kostki bulionowej (bulion cielęcy Knorr) dodać około 75 ml wody destylowanej, gotować we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po wystudzeniu przesączyć do kolby miarowej o pojemności 100 ml przez gazę młyńską i uzupełnić do kreski wodą destylowaną. Po lekkim wystudzeniu przesączyć roztwór przez sączek z bibuły i rozcieńczyć 0,1 M HCl 20-krotnie (0,5 ml roztworu na 19,5 ml kwasu). Dla tak przygotowanych próbek zmierzyć wartości absorbancji przy trzech długościach fali: 249, 262 i 290 nm. Te wartości pozwalają odnotować różnice w zabarwieniu poszczególnych roztworów.

Część praktyczna doświadczenia:

- dla adeniny (roztwór standardowy): ΔE_(262-290) = 0,900

- dla guaniny (roztwór standardowy): ΔE_(262-290) = 0,457

Tabela 1 – Różnice ekstynkcji dla roztworów badanych

Kostka	Adenina ΔE(262-290)	Guanina ΔE(249-290)
Bulion grzybowy Knorr	0,248	0,175
Bulion grzybowy Winiary	0,311	0,258
Rosół drobiowy Winiary	0,143	0,144
Bulion na włoszczyźnie	0,118	0,115
Rosół z kury Kucharek	0,235	0,241
Bulion cielęcy Knorr	0,322	0,311
Bulion wołowy Knorr	0,081	0,046
Rosół z kury Knorr	0,146	0,071

Przykład obliczeń zawartości zasad azotowych w kostkach spożywczych wyróżnionych w tabeli kolorem czerwonym:

Dla adeniny:

Dla guaniny:

Tabela 2 – Zawartość zasad azotowych w poszczególnych kostkach spożywczych

Kostka	Adenina [mg/g kostki]	Guanina [mg/g kostki]
Bulion grzybowy Knorr	1,102	1,532
Bulion grzybowy Winiary	1,380	2,256
Rosół drobiowy Winiary	0,636	1,26
Bulion na włoszczyźnie	0,524	1,001
Rosół z kury Kucharek	1,044	2,109
Bulion cielęcy Knorr	1,431	2,722
Bulion wołowy Knorr	0,36	0,404
Rosół z kury Knorr	0,649	0,621

Wnioski:

Najmniejszą zawartość puryn (około 0,5 – 1 mg/g kostki) wykazują kostki pochodzenia drobiowego i roślinnego, największą (około 1,3 – 2,7 mg/g kostki) - kostki grzybowe i cielęce. Bardzo niska zawartość zasad w bulionie wołowym Knorr (0,36 – 0,404 mg/g kostki) wynika z błędów popełnionych podczas wykonywania doświadczenia przez grupę, która opracowywała ten podpunkt. Podsumowując – doświadczenie to pozwoliło potwierdzić obecność zasad purynowych w kostkach spożywczych.

1. Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową

Wykonanie ćwiczenia:

Ćwiczenie składa się z dwóch etapów: ekstrakcji DNA i jego oznaczenia.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych:

Około 5 g wątroby wieprzowej lub około 2,5 g mleczu ze śledzia zhomogenizować z 50 ml zimnego 10% roztworu kwasu trój chlorooctowego, następnie odwirować homogenat. Ciecz nadosadową usunąć, do osadu dodać 30 ml 0,6 M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewać przez 15 minut w łaźni wodnej (90 stopni) mieszając. Po ostudzeniu odwirować osad, supernatant przenieść do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Uzupełnić kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszać. W tak otrzymanej próbie oznaczyć zawartość DNA.

Oznaczanie DNA:

Do 1 ml uzyskanego ekstraktu dodać 1 ml wody destylowanej. Następnie dodać 4 ml odczynnika difenyloaminowego. Próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i inkubować przez 10 minut. Następnie ochłodzić i zmierzyć absorbancji przy długości fali 600 nm. Równolegle wykonać próbę wzorcową zawierającą 1 ml DNA o stężeniu 200 μg/ml zmieszany z 1 ml wody destylowanej. Dalej postępować analogicznie.

Wyniki:

Tabela 3 – Absorbancje prób badanych przy długości fali 600 nm

Materiał	Absorbancja 1	Absorbancja 2	Średnia	Średnia całkowita	Zawartość DNA [mg/100g]
Mlecz ze śledzia próba 1	0,570	0,599	0,585	0,591	972,84
Mlecz ze śledzia próba 2	0,647	0,548	0,598
Wątroba wieprzowa próba 1	-	0,268	0,268	0,243	194,7
Wątroba wieprzowa próba 2	0,207	0,242	0,225

Przykład obliczeń dla próby z mleczem śledzia:

Wnioski:

Mlecz ze śledzia charakteryzuje się dużo wyższą zawartością DNA niż wątroba wieprzowa (972,84 w stosunku do 194,7 mg DNA/100 g materiału badanego). Doświadczenie to pozwoliło potwierdzić obecność kwasów nukleinowych w tkankach zwierzęcych.