Dr hab. Latajka
Jak zbadać strukturę peptydu?
Pierwszorzędową:
Degradacja Edmana - metoda sekwencjonowania peptydów polegająca na kolejnym odrywaniu oznakowanych aminokwasów z N-końca cząsteczki peptydu. Degradację Edmana wykonuje się w dwóch etapach, zasadowym i kwaśnym. Pierwszy etap to reakcja N-fenyloizotiocyjanianu z terminalną grupą aminową (-NH2), która w łagodnym środowisku alkalicznym występuje w formie obojętnej (niesprotonowanej). Otrzymany w ten sposób związek, pochodna tiomocznika, w następnym etapie w środowisku kwasu solnego ulega cyklizacji i rozpadowi do heterocyklicznego produktu degradacji nazywanego fenylotiohydantoinową pochodną aminokwasu (tzw. PTH-aminokwasu) oraz peptydu, krótszego o jeden aminokwas. Powstające PTH-aminokwasy są identyfikowane za pomocą chromatografii lub elektroforezy.
Strategia sekwencjonowania – większe białka rozszczepia się na mniejsze fragmenty wielkości 20-100 reszt za pomocą metod chemicznych (bromocyjan tnie po stronie karboksylowej reszt Met) lub enzymatycznych (trypsyna lub chymotrypsyna tnie po stronie karboksylowej aminokwasów zasadowych (Arg, Lys) i aromatycznych (Phe, Trp, Tyr)), które następnie rozdziela się stosując metody chromatografii i sekwencję każdego z nich ustala się stosując degradację Edmana. Należy wykorzystać nakładające się fragmenty białka otrzymane dwoma metodami trawienia, aby ustalić całą sekwencję łańcucha.
Aby otrzymać informację o kolejności aminokwasów znajdujących się na końcu N stosuje się aminopeptydazy, natomiast na końcu C karboksypeptydazy, które usuwają po jednym aminokwasie z końca łańcucha polipeptydowego.
Czynniki denaturujące (rozdział podjednostek): mocznik, chlorowodorek guanidyny (oddziaływania niekowalencyjne)
Redukcja mostków disiarczkowych: β-merkaptoetanol, ditiotreitol
Zapobieganie ponownej rekombinacji reszt cysteiny: jodooctan
Sekwencjonowanie metodą spektrometrii masowej - do określania sekwencji wykorzystuje się tandemowe spektrometry mas, które pozwalają na wyselekcjonowanie jonów peptydowych, ich fragmentację i pomiar mas molowych powstałych fragmentów. Fragmentacja polipeptydu zachodzi najczęściej przy wiązaniach peptydowych, dzięki czemu dane o masach fragmentów pozwalają na ustalenie sekwencji aminokwasowej peptydów. Podczas sekwencjonowania peptydu w spektrometrze mas nie można odróżnić aminokwasów: leucyny od izoleucyny oraz lizyny od glutaminy. Leucyna i izoleucyna mają identyczne masy molowe, gdyż są swoimi izomerami. Lizyna i glutamina pomimo innego składu pierwiastkowego mają bardzo podobne masy. Metoda sekwencjonowania w spektrometrze mas pozwala na określenie sekwencji aminokwasowej peptydów o długości do około 30 aminokwasów. Dodatkowo w roztworze może znajdować się kilka peptydów, które mogą być razem zsekwencjonowane. SM umożliwia również badanie peptydów z zablokowanym N-końcem oraz modyfikacje potranslacyjne aminokwasów, takie jak glikozylacja czy fosforylacja.
Drugorzędową:
Zjawisko dichroizmu kołowego (CD - z ang. Circular Dichroism) znalazło szerokie zastosowanie w badaniach konformacji biopolimerów w roztworze. W metodzie CD wykorzystuje się występowanie aktywności optycznej w polipeptydach i białkach, manifestującej się w skręceniu płaszczyzny polaryzacji światła oraz pojawieniu się polaryzacji eliptycznej. Efekty te można wytłumaczyć następująco.
Przy wzbudzaniu próbki światłem spolaryzowanym liniowo można traktować wektor elektryczny takiej fali świetlnej jako sumę wektorów elektrycznych dwóch, o tej samej amplitudzie i fazie, lecz o przeciwnych kierunkach rotacji (polaryzacja prawo- i lewoskrętna), spolaryzowanych kołowo fal świetlnych. W ośrodku aktywnym optycznie występują różnice w prędkościach rozchodzenia się tych fal, (różnice we współczynnikach załamania światła), jak i we współczynnikach absorpcji. Efekt pierwszej różnicy to przesunięcie w fazie wektorów pola elektromagnetycznego obu składowych względem siebie, co prowadzi do skręcenia wypadkowego wektora po przejściu przez ośrodek optycznie aktywny o pewien kąt. Zaś różnica we współczynnikach absorpcji powoduje różnicę amplitud dla obu fal, co z kolei prowadzi do pojawienia się polaryzacji eliptycznej.
Trzeciorzędową:
Do najskuteczniejszych metod określania przestrzennej struktury białka zaliczają się krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR, ang. nuclear magnetic resonance). Obie z nich są metodami eksperymentalnymi. Pierwsza z nich polega na otrzymaniu kryształów badanego białka i poddaniu ich działaniu promieniowania rentgenowskiego, w celu jego rozproszenia. Otrzymany w ten sposób obraz dyfrakcyjny dostarcza ogromnej ilości informacji, które pozwalają wyznaczyć położenie poszczególnych atomów w analizowanym białku, a w konsekwencji jego strukturę. Jest to obecnie najlepsza metoda wykorzystywana do tego celu. Drugi przedstawiony sposób, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego polega na baniu przesunięć chemicznych w stałym polu magnetycznym, które bezpośrednio zależą od ich lokalnego otoczenia. Z uzyskanych w ten sposób informacji o oddziaływaniu spinów położonych blisko siebie jąder, możliwe jest całkowite wyznaczenie struktury przestrzennej białka. Plusem tej metody jest to, że nie wymaga ona kryształów białek, a jedynie ich silnie stężonego roztworu.
Modelowania komputerowego – wyróżniamy w nim dwie główne kategorie. Pierwszą z nich są metody oparte na szablonach, wśród których wyróżniamy modelowanie homologiczne oraz rozpoznawanie zwoju. Drugą jest podejście ab initio. Modelowanie komputerowe umożliwia między innymi wyjaśnienie pełnej funkcji danego polipeptydu, do której określenia wymagana jest często znajomości jego konfiguracji przestrzennej [1]. Dostarcza również użytecznych informacji, które mogą być wykorzystywane do wsparcia projektowania nowoczesnych leków.
Czwartorzędowa:
Reakcje charakterystyczne alkoholi
estryfikacja – reakcja chemiczna, w wyniku której powstają estry. Najczęściej zachodzi ona pomiędzy kwasami (głównie karboksylowymi) i alkoholami (szerzej: związkami zawierającymi grupę hydroksylową)
Reakcja z aktywnymi metalami (litowcami lub berylowcami):
Reakcja z kwasami fluorowcowodorowymi np:
Reakcja eliminacji wody np:
Reakcja utleniania alkoholi I-rzędowych do aldehydów i ketonów np:
Reakcja spalania alkoholu - reakcja przebiega z udziałem tlenu i podobnie jak przw węglowodorach produktem może być dwutlenek węgla, tlenek węgla(II) lub węgiel. Dwa ostatnie produkty powstają przy niedostatecznej ilości tlenu.
Spektrofotometria
Spektrofotometria – technika pomiarowa polegająca na ilościowym pomiarze transmisji lub odbicia światła przez próbkę. Od połowy XX wieku stanowi główne narzędzie spektroskopii absorpcyjnej i odbiciowej w bliskim nadfiolecie i świetle widzialnym, a dawniej również w podczerwieni, znajdując szerokie zastosowanie w chemii analitycznej, biologii, medycynie i badaniach materiałowych.
Typowe spektrofotometry UV-VIS umożliwiają pomiar w całym zakresie światła widzialnego oraz bliskim nadfiolecie, a więc w przedziale 180/200–800 nm
Spektrofotometr charakteryzowany jest przez następujące parametry:
zakres spektralny – przedział widma, w którym spektrofotometr może dokonać pomiaru,
spektralna zdolność rozdzielcza – najmniejsza możliwa do uzyskania na danym przyrządzenie spektralna szerokość wiązki przy danej długości fali,
spektralna szerokość wiązki – szerokość połówkowa rozkładu energii wiązki wychodzącej z monochromatora,
dokładność skali,
procentowa zawartość światła rozproszonego.
Spektroskopia w podczerwieni, spektroskopia IR (z ang. infrared spectroscopy) − rodzaj spektroskopii, w której stosuje się promieniowanie podczerwone. Najpowszechniej stosowaną techniką IR jest absorpcyjna spektroskopia IR, służąca do otrzymywania widm oscylacyjnych (choć w zakresie dalekiej podczerwieni obserwuje się także przejścia rotacyjne). Przy pomocy spektroskopii IR można ustalić jakie grupy funkcyjne obecne są w analizowanym związku.
Spektroskopia w podczerwieni pozwala na analizę zarówno struktury cząsteczek jak i ich oddziaływania z otoczeniem. Jest to jedna z podstawowych metod stosowanych w badaniu wiązań wodorowych. Metodą komplementarną do spektroskopii IR jest spektroskopia Ramana.
Promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu IR ma częstotliwość zbliżoną do częstotliwości drgań cząsteczek. Przechodząc przez próbkę badanej substancji promieniowanie to jest selektywnie pochłaniane, zwiększając amplitudę drgań w cząsteczkach (czy też kryształach) tej substancji. W analizie tych pasm dla układów wieloatomowych stosuje się pojęcie drgań normalnych, traktując każde pasmo jako wynik wzbudzenia jednego (tony podstawowe) lub kilku (tony kombinacyjne) drgania normalnego. Od symetrii cząsteczki zależy, które drgania normalne znajdą swoje odzwierciedlenie w widmie absorpcyjnym w zakresie podczerwieni.
Absorpcji promieniowania podczerwonego towarzyszą zmiany energii oscylacyjnej cząsteczek. Ponieważ energia ta jest skwantowana, absorbowane jest tylko promieniowanie o pewnych określonych energiach, charakterystycznych dla grup funkcyjnych wykonujących drgania. Dzięki temu, wartości częstości drgań charakterystycznych mogą być ujęte w formie odpowiednich tabel, i absorpcyjne widmo IR umożliwia ustalenie jakie grupy funkcyjne występują w analizowanej próbce. Warunkiem absorpcji promieniowania (czyli możliwości wzbudzenia drgania przez promieniowania) jest zmienność momentu dipolowego cząsteczki w trakcie tego drgania.
W absorpcyjnym widmie IR dominują pasma związane z tonami podstawowymi drgań cząsteczek. Możliwa jest także rejestracja nadtonów oraz tonów kombinacyjnych i różnicowych (jednoczesnych przejść w dwóch lub więcej oscylatorach), są jednak one znacznie słabsze.
Określone grupy funkcyjne związków organicznych charakteryzują się ściśle określonym zakresem absorpcji promieniowania podczerwonego. Częstotliwość, przy której dana grupa funkcyjna absorbuje promieniowanie IR nazywa się częstotliwością grupową, a takie drganie grupy funkcyjnej – drganiem charakterystycznym.
Widma IR są bardzo złożone i niezwykle rzadko zdarza się, aby dwa różne związki chemiczne miały w całym zakresie identyczne widma, co praktycznie umożliwia jednoznaczną ich identyfikację. Zastosowanie bazy danych z częstościami określonych pasm obecnych w danych związkach chemicznych pozwala na identyfikację związków chemicznych w badanej próbce (zob. np. Spectral Database for Organic Compounds SDBS). Ponadto dostępne są tablice ułatwiające analizę składu ilościowego badanych próbek.
Spektroskopia elektronowa (ang. Electron Spectroscopy) – jedna z podgrup spektroskopii, wykorzystująca zjawiska na poziomie oddziaływań elektron - próbka. Służy głównie do poznawania i badania struktury elektronowej, wiązań chemicznych oraz składu chemicznego materiałów.
Głównymi źródłami informacji są:
Wyróżniamy dwa mechanizmy zderzeń elektronów:
W przypadku sprężystego zderzenia elektronu możemy rejestrować zjawiska dyfrakcji opierające się na teorii dualizmu korpuskularno-falowego oraz elektrony wstecznie rozproszone. Gdy dojdzie do zderzenia niesprężystego i w efekcie utraty części energii kinetycznej elektronów aparatura badawcza może zarejestrować rozpraszanie fononowe, rozpraszanie plazmonowe, wzbudzenie elektronów wtórnych czy bezpośrednie straty promieniowania. Rejestruje się również zjawiska pośrednie tj. emisje promieniowania rentgenowskiego i katodoluminescencje.
Wiązania międzycząsteczkowe i oddziaływania międzycząsteczkowe
Wiązanie kowalencyjne - rodzaj wiązania chemicznego. Istotą wiązania kowalencyjnego jest istnienie pary elektronów, które są współdzielone w porównywalnym stopniu przez oba atomy tworzące to wiązanie.
Wiązania kowalencyjne dzielimy na niespolaryzowane i spolaryzowane. Para elektronowa wiązania niespolaryzowanego należy w równym stopniu do obu atomów, natomiast w wiązaniu spolaryzowanym elektrony przesunięte są w kierunku jednego z atomów.
Wiązanie koordynacyjne (donorowo-akceptorowe) – rodzaj kowalencyjnego wiązania chemicznego, którego istotą jest uwspólnienie pary elektronowej między dwoma atomami, przy czym oba te elektrony formalnie pochodzą od jednego atomu.
W wiązaniach koordynacyjnych wyróżnia się atom donora (dostarczyciela) i akceptora (przyjmującego) elektronów. W większości przypadków donorem elektronów jest atom bardziej elektroujemny, a akceptorem bardziej elektrododatni, choć istnieją też nieliczne przypadki, gdy jest na odwrót. Czasem jednak oba związane atomy są jednocześnie donorami i akceptorami – przykłady: wiązanie metal-fosfor, metal-alken, metal-aren, metal-tlenek węgla. W takich przypadkach wiązanie ma podwójny charakter: donorowy (donacja od liganda do metalu) i redonorowy (inaczej: zwrotny, ang. back-bonding, od metalu do liganda).
Wiązanie jonowe (inaczej elektrowalencyjne, heteropolarne lub biegunowe) – rodzaj wiązania chemicznego, którego istotą jest elektrostatyczne oddziaływanie między jonami o różnoimiennych ładunkach.
Wiązanie to powstaje najczęściej między metalem a niemetalem. Różnica elektroujemności w skali Paulinga jest większa lub równa 1,7. Największy udział tego rodzaju wiązania można zaobserwować w związkach litowców z fluorowcami. Teoretycznie najsilniejszym wiązaniem jonowym charakteryzuje się fluorek fransu – FrF, gdyż posiada największą różnicę elektroujemności.
Praktycznie, aby ustalić czy wiązanie jest jonowe czy kowalencyjne, wykonuje się pomiar gęstości elektronowej wokół atomów tworzących wiązanie za pomocą rentgenografii strukturalnej. Jeśli w przestrzeni między atomami występuje obszar, gdzie gęstość elektronowa jest tak mała, że nie da się jej zmierzyć, a zatem chmury elektronowe wokół obu atomów są wyraźnie rozdzielone, to przyjmuje się, że wiązanie ma istotnie charakter jonowy.
Wiązanie wodorowe – (tzw. mostek wodorowy) rodzaj stosunkowo słabego wiązania chemicznego polegającego głównie na przyciąganiu elektrostatycznym między atomem wodoru i atomem elektroujemnym zawierającym wolne pary elektronowe.
Klasyczne wiązanie wodorowe powstaje, gdy atom wodoru jest połączony wiązaniem kowalencyjnym z innym atomem o dużej elektroujemności (np. tlenem) i w ten sposób uzyskuje nadmiar ładunku dodatniego. W wyniku tego oddziaływania pierwotne, kowalencyjne wiązanie między wodorem a innym atomem ulega częściowemu osłabieniu, powstaje zaś nowe, stosunkowo słabe wiązanie między wodorem i innym atomem (akceptorem wiązania wodorowego). Nie można wytłumaczyć natury tego wiązania wyłącznie za pomocą elektrostatyki, ponieważ oprócz przyciągania elektrostatycznego, zachodzi przeniesienie ładunku z akceptora na atom wodoru i związane z nim atomy, a także polaryzacja chmury elektronowej zarówno akceptora, jak i donora wiązania wodorowego.
Oddziaływania międzycząsteczkowe – inne niż wiązania chemiczne siły wiążące atomy i cząsteczki.
Do oddziaływań tych zalicza się (w kolejności od najsilniejszych do najsłabszych):
oddziaływania jon-jon (elektrostatyczne) – zachodzą między dwiema różnoimiennie naładowanymi cząsteczkami; od wiązań jonowych różni je to, że ładunek w oddziałujących ze sobą cząsteczkach nie jest skoncentrowany na jednym atomie, lecz jest zdelokalizowany na kilku-kilkunastu atomach; siła ich oddziaływania jest proporcjonalna do 1/r2 (gdzie r – odległość między cząsteczkami); w przypadku ośrodka zawierającego inne ładunki (np. roztworu elektrolitu) efekt oddziaływania jest mniejszy; (zobacz też: para jonowa);
wiązania wodorowe – tworzą się, gdy atom wodoru z cząstkowym ładunkiem dodatnim jest współdzielony przez dwie cząsteczki, które posiadają atomy z cząstkowym ładunkiem ujemnym; wiązania wodorowe, jeśli występują w obrębie jednej cząsteczki, są często traktowane jak słabe wiązanie chemiczne; jeśli jednak wiąże ono dwie lub więcej cząsteczek, można je traktować jako oddziaływanie międzycząsteczkowe;
oddziaływania trwały dipol – trwały dipol – tworzą się między cząsteczkami posiadającymi trwałe momenty dipolowe; cząsteczki takie posiadają w jednych miejscach nadmiar ładunku ujemnego, a w innych jego niedomiar; oddziałują one ze sobą tak jak jony – tyle, że oddziaływanie to jest słabsze, gdyż w grę wchodzą cząstkowe, a nie całkowite ładunki elektryczne, a także przyciąganiu pomiędzy ładunkami różnoimiennymi towarzyszy zawsze odpychanie pomiędzy ładunkami jednoimiennymi;
oddziaływania van der Waalsa – są to oddziaływania między trwałym dipolem i indukowanym (wzbudzonym) dipolem. W cząsteczkach, które nie posiadają trwałego momentu dipolowego, może on być wzbudzany przez cząsteczki z trwałym momentem; następnie taki wzbudzony dipol i trwały dipol oddziałują na siebie podobnie jak dwa trwałe dipole, tyle że znacznie słabiej; w cząsteczkach bez trwałego momentu dipolowego występują natomiast stochastyczne fluktuacje ich chmur elektronowych, powodujące powstawanie chwilowych momentów dipolowych; cząsteczka posiadająca chwilowy moment dipolowy może go wzbudzić w cząsteczce sąsiadującej, wskutek czego obie cząsteczki mogą się nawzajem chwilowo przyciągać lub odpychać. Uśrednienie sił odpychających i przyciągających daje w wyniku oddziaływanie przyciągające proporcjonalne do 1/r6; oddziaływania van der Waalsa wynikają m.in. z korelacji ruchów elektronów pomiędzy oddziałującymi atomami – dlatego w metodach obliczeniowych nieuwzględniających korelacji elektronowej sił tych praktycznie nie ma.
oddziaływania dyspersyjne, zwane też siłami dyspersyjnymi Londona (odpowiadające oddziaływaniu między dipolami indukowanymi).