SPRAWOZDANIE

Temat: Trawienie króliczej aldolazy mięśniowej karboksypeptydazą A (CPA).

Cel doświadczenia:

Celem doświadczenia było zbadanie zmiany aktywności aldolazy w czasie, trawionej karboksypeptydazą A.

Przebieg doświadczenia:

Przygotowano 12 probówek chemicznych. Do probówek opisanych K1’, K50’, 1’, 3’, 6’,9’, 15’, 25’, 35’, dodano po 500 μl buforu (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) i pozostawiono do dalszej części doświadczenia.

Do kuwety pomiarowej „próbka” dodano 2 ml buforu (10 mM Tris/HCl, pH 7.2) i 20 μl wyjściowego

roztworu aldolazy. Zmierzono absorbancję przy 280 nm i wyznaczono stężenie otrzymanej próbki aldolazy.

Następnie wyznaczono aktywność enzymatyczną otrzymanej próbki aldolazy. W tym celu wykonano test hydrazynowy dla rozcieńczonego roztworu aldolazy.

Do probówki chemicznej „A 1 $\frac{\text{mg}}{\text{ml}}$” dodano 2,4 ml buforu (10 mM Tris/HCl, pH 7,2) oraz 146 μl wyjściowego roztworu aldolazy . Do probówek P i K dodano po 1 ml roztworu „A 1 $\frac{\text{mg}}{\text{ml}}$” oraz wstawiono je do łaźni wodnej o temperaturze 25°C.

Do probówki K dodano 54 μl 10% chlorku litu a do probówki P dodano 54 μl CPA. Włączono stoper.

Po 1 minucie do probówki K1’ dodano 50 μl roztworu z probówki K. Roztwór K1’ wymieszano. Dla tak przygotowanego roztworu wykonano test hydrazynowy.

Analogicznie postąpiono wykonując pomiar dla próbek do których dodano karboksypeptydazę odpowiednio po 1, 3, 6, 9, 15, 25 i 35 minutach. Dla każdego z roztworów zmierzono absorbancję względem odnośnika przy 240 nm.

Po około 70 minutach do probówki K50’ dodano 50 μl roztworu z probówki K. Analogicznie zmierzono absorbancję względem świeżo wykonanego odnośnika przy 240 nm.

Opracowanie wyników:

1. Wyznaczono stężenie aldolazy w probówce „ald” przez pomiar absorbancji:

Abs₂₈₀ = 0,1544

$$C_{\text{ald}}^{2} = \ \frac{A}{\varepsilon \bullet l} = \ \frac{0,1544}{0,91\frac{\text{ml}}{\text{mg}\ \bullet \text{cm}} \bullet 1\ \text{cm}} = 0,1697\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}$$

1. Wyznaczono aktywność enzymatyczną aldolazy testem hydrazynowym:

$$V_{2}^{'} = \frac{m_{\text{ald}}}{C_{\text{ald}}^{2}} = \ \frac{5\ \text{μg}\ }{0,1697\ \frac{\text{μg}}{\text{μl}}} = \ 295\ \text{μl}$$

$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{3} = \frac{\frac{{A}_{240}}{t}}{\varepsilon_{H} \bullet l}\ = \ \frac{0,3298\ \frac{1}{\min}}{2,73\frac{1}{\text{mM}\ \bullet \text{cm}} \bullet 1\ \text{cm}} = 0,121\frac{U}{\text{ml}}$$

$$R_{2} = \frac{1500\ \mu l + 200\ \mu l + 295\ \mu l\ }{295\ \mu l} = \ 6,78\ \sim\ 7$$

$C_{\text{ald}}^{3} = \ \frac{C_{\text{ald}}^{2}}{R_{2}} = \ \frac{0,1697\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}}{7} = 0,0242\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}\ $

$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{3} = \frac{\text{Akt}_{\text{ald}}^{3}}{C_{\text{ald}}^{3}} = \frac{0,121\ \frac{U}{\text{ml}}}{0,0242\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}\ } = 5\frac{U}{\text{mg}}$$

Tabela 1. Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwecie zawierającej mieszaninę testową do testu hydrazynowego.

V2^′[μl]	R2	$$C_{\text{ald}}^{3}\lbrack\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\frac{{A}_{240}}{t}\ {{\lbrack\frac{1}{\min}\rbrack}^{}}^{*}$$	$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{3}\lbrack\frac{U}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{3}\lbrack\frac{U}{\text{mg}}\rbrack$$
295	7	0, 0242	0, 329	0, 121	5

*$\ \text{Warto}sc\ \text{odczytana}\ z\ \text{wykresu}\ \mathrm{\ "pomiar\ pierwszy".}$

$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{2} = \text{Akt}_{\text{ald}}^{3} \bullet R_{2} = 0,121\ \frac{U}{\text{ml}} \bullet 7 = 0,847\ \frac{U}{\text{ml}}$$

$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{2} = \frac{\text{Akt}_{\text{ald}}^{2}}{C_{\text{ald}}^{2}} = \frac{0,847\ \frac{U}{\text{ml}}}{0,1697\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}\ } = 4,991\frac{U}{\text{mg}}$$

Tabela 2. Obliczenia dla roztworu aldolazy w probówce „ald”.

A280	$$C_{\text{ald}}^{2}\lbrack\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{2}\lbrack\frac{U}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{2}\lbrack\frac{U}{\text{mg}}\rbrack$$
0, 1544	0, 1697	0, 847	4, 991

1. Wyznaczono aktywność aldolazy w preparacie wyjściowym:

$$R_{1} = \frac{2000\ \mu l + 20\ \mu l\ }{20\ \mu l} = \ 101\ $$

$$C_{\text{ald}}^{1} = \ R_{1} \bullet C_{\text{ald}}^{2} = 101 \bullet 0,1697\frac{\text{mg}}{\text{ml}} = 17,139\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}\ $$

$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{1} = \text{Akt}_{\text{ald}}^{2} \bullet R_{1} = 0,847\ \frac{U}{\text{ml}} \bullet 101 = 85,547\ \frac{U}{\text{ml}}$$

$$\text{Akt}_{\text{tot}}^{1} = \text{Akt}_{\text{ald}}^{1} \bullet V_{\ 1} = 85,547\ \frac{U}{\text{ml}} \bullet 1\ ml = 85,547\ U$$

$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{1} = \frac{\text{Akt}_{\text{ald}}^{1}}{C_{\text{ald}}^{1}} = \frac{85,547\ \frac{U}{\text{ml}}}{17,139\ \frac{mg}{\text{ml}}} = 4,991\frac{U}{\text{mg}}$$

Tabela 3. Obliczenia dla roztworu aldolazy w preparacie wyjściowym.

$$C_{\text{ald}}^{1}\lbrack\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{1}\lbrack\frac{U}{\text{ml}}\rbrack$$	Akttot^1[U]	$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{1}\lbrack\frac{U}{\text{mg}}\rbrack$$
17, 139	85, 547	85, 547	4, 991

1. Wykonano obliczenia dla roztworu aldolazy o stężeniu $1\frac{\text{mg}}{\text{ml}}:$

C_ald¹  •  V_ald¹ =  C_ald⁴  •  V₄ 

$$V_{\text{ald}}^{1} = \ \frac{C_{\text{ald}}^{4}\ \bullet \ V_{4}\ }{C_{\text{ald}}^{1}} = \ \frac{1\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet \ 2,5\ ml}{17,1397\frac{\text{mg}}{\text{ml}}} = \ 0,146\ ml = 146\ \mu\text{l\ }$$

V₄ =  V_ald¹ +  V_buforu¹ → V_buforu¹ =  2, 5 ml − 0, 146 ml = 2, 354 ml  ∼ 2, 4 ml

1. Wykonano obliczenia dla karboksypeptydazy A o stężeniu $0,002\frac{\text{mg}}{\text{ml}}:$

$$C_{\text{ald}}^{4} = 1\frac{\text{mg}}{\text{ml}} = 1\frac{g}{\text{dm}^{3}}$$	$C_{\text{CPA}} = 0,002\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}} = 0,002\frac{g}{\text{dm}^{3}}\ $	Mald = 160 kDa	MCPA = 34, 4 kDa
Vald^′ = 1ml = 0, 001 dm^3

$$C_{\text{CPA}}^{M} = \ \frac{\ 0,002\ g}{\text{dm}^{3}}:M_{\text{CPA}} = \ \ \frac{0,002\ g:34400\ Da}{\text{dm}^{3}} = 5,814 \bullet 10^{- 8}\frac{\text{mol}}{\text{dm}^{3}}$$

$$C_{\text{ald}}^{M} = \ \frac{1\ g}{\text{dm}^{3}}:M_{\text{ald}} = \frac{1\ g:160000\ Da}{\text{dm}^{3}} = \ 6,25 \bullet \ 10^{- 6}\ \frac{\text{mol}}{\text{dm}^{3}}$$

$$\frac{1}{2000} = \ \frac{n_{\text{CPA}}}{n_{\text{ald}}} = \ \frac{C_{\text{CPA}}^{M} \bullet V_{\text{CPA}}}{C_{\text{ald}}^{M} \bullet V_{\text{ald}}^{'}}\ \ \ \ \ \rightarrow \ \ \ \ \frac{1}{2000} = \ \frac{5,814 \bullet \ 10^{- 8}\ \frac{\text{mol}}{\text{dm}^{3}}\ \bullet V_{\text{CPA}}\ }{6,25 \bullet \ 10^{- 6}\ \frac{\text{mol}}{\text{dm}^{3}}\ \bullet 0,001\text{dm}^{3}\text{\ \ }}\ $$

V_CPA = 5, 375  •  10⁻⁵ dm³ = 54  μl

$$R_{3} = \frac{V_{\text{CPA}} + {V'}_{\text{ald}}}{{V'}_{\text{ald}}} = \frac{54\ \mu l + 1000\ \mu l\ }{1000\mu l} = \ 1,054\ \sim 1$$

1. Wykonano obliczenia dla roztworów aldolazy trawionej CPA:

Przykładowe obliczenia dla K_1’ (wykres drugi pomiar):

$$R_{4} \bullet \ R_{5} = \ \frac{V_{\text{buforu}} + \ V_{5}^{'}}{V_{5}^{'}}\ \bullet \ \frac{V_{\text{t.h.}} + \ V_{\text{traw}}}{V_{\text{traw}}} = \ \frac{500\ \mu l + 50\ \mu l\ }{50\ \mu l}\ \bullet \ \frac{1700\ \mu l + 50\ \mu l}{50\ \mu l} = 385$$

$$C_{\text{ald}}^{5} = \ \frac{C_{\text{ald}}^{4}}{R_{3} \bullet \ R_{4} \bullet \ R_{5}} = \frac{1\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}}{1,054 \bullet 385} = 2,43\ \bullet \ 10^{- 3}\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}$$

$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{5} = \frac{\frac{{A}_{240}}{t}}{\varepsilon_{H} \bullet l}\ = \ \frac{0,0569\ \frac{1}{\min}}{2,73\frac{1}{\text{mM}\ \bullet \text{cm}} \bullet 1\ \text{cm}} = 0,0208\frac{U}{\text{ml}}$$

$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{5} = \frac{\text{Akt}_{\text{ald}}^{5}}{C_{\text{ald}}^{5}} = \frac{0,0208\frac{U}{\text{ml}}}{2,43\ \bullet \ 10^{- 3}\ \frac{mg}{\text{ml}}} = 8,577\frac{U}{\text{mg}}$$

Analogiczne obliczenia wykonano dla pozostałych przykładów. Uwzględniono wszystkie zmiany objętości V_traw .

Tabela 4. Obliczenia dla roztworów trawionej aldolazy w kuwetach.

Probka	Vtraw[μ]	R4 •  R5	$$C_{\text{ald}}^{5}\ \lbrack\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\frac{{A}_{240}}{t}\lbrack\frac{1}{\min}\rbrack$$	$$\text{Akt}_{\text{ald}}^{5}\lbrack\frac{U}{\text{ml}}\rbrack$$	$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{5}\lbrack\frac{U}{\text{mg}}\rbrack$$
K1′	50	385	0, 00243	0,0569	0,0208	8,577
1′	50	385	0, 00243	0,0547	0,0200	8,246
3′	50	385	0, 00243	0,0735	0,0269	11,079
6′	50	385	0, 00243	0,0457	0,0167	6,889
9′	50	385	0, 00243	0,0417	0,0153	6,286
15′	50	385	0, 00243	0,0280	0,0103	4,221
25′	100	198	0, 00479	0,0344	0,0126	5,185
35′	200	104, 5	0, 00908	0,0384	0,0141	5,788
K50′	150	135, 7	0, 00699	0,1151	0,0422	6,037

Wykonano obliczenia dla roztworu trawionej aldolazy (P) i w próbie kontrolnej (K):

$$\text{Akt}_{\text{tot}}^{5} = \text{Akt}_{\text{ald}}^{5} \bullet \left( V_{\ 4} + V_{\text{CPA}} \right) = 0,0208\frac{U}{\text{ml}} \bullet \left( 1 + 0,054 \right)\ ml = 0,0219\ U$$

Tabela 5. Obliczenia dla roztworu trawionej aldolazy (P) i w próbie kontrolnej (K).

Czas trawienia [min.]	Akttot^5[U]	$$\text{Akt}_{\text{spec}}^{5}\lbrack\frac{U}{\text{mg}}\rbrack$$	Aktspec^5[%]
1	0,0211	8,246	96,13
3	0,0284	11,079	129,17
6	0,0176	6,889	80,32
9	0,0161	6,286	73,29
15	0,0108	4,221	49,21
25	0,0133	5,185	60,46
35	0,0148	5,788	67,49
Próby kontrolne (K)	1	0,0219	8,577
	70	0,0445	6,037

Wykres 1. Wykres zależności Akt_spec⁵ = f(t) .

Wnioski:

Cel doświadczenia zrealizowano – zbadano zmianę aktywności aldolazy w czasie, trawionej karboksypeptydazą A. Wbrew oczekiwaniom nie zanotowano spadku aktywności specyficznej aldolazy w trakcie przebiegu całego doświadczenia. Wyraźny spadek zauważono kolejno w 6, 9 i 15 minucie względem minuty 1 . Użyta karboksypeptydaza A trawiła C-końcowe wiązania aldolazy [2]. Po czym nastąpił wzrost aktywności w minutach 25 i 35. Wynik całkowicie odbiegający od norm zanotowano w 3 minucie a procentowa aktywność specyficzna aldolazy osiągnęła wartość 129,17. Przyczyną uzyskanych wyników mógł być błąd pomiarowy komputera, bądź osób wykonujących eksperyment. Co więcej, nieprawidłowe wyniki mogły być spowodowane nie dość szybkim wykonaniem testu hydrazynowego.

W pierwszej części doświadczenia wyznaczono aktywność specyficzną aldolazy w roztworze wyjściowym, która wyniosła około 5 $\frac{U}{\text{mg}}$ . Jest to wartość niższa od wartości literaturowej, która wynosi 10-12 $\frac{U}{\text{mg}}$ [1]. Przyczyną mogły być odmienne warunki przeprowadzania doświadczenia, bądź też inna metoda otrzymania stężonego roztworu aldolazy.

Literatura:

[1] Penhoet E., Rajkumar T., Rutter WJ., Multiple forms of fructose diphosphate aldolase in mammalian tissues, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 56,1966, 1275-1282.

[2] Kovaleva, ES; Masler, EP; Subbotin, SA; Chitwood, DJ; Molecular characterization of aldolase from Heterodera glycines and Globodera rostochiensis, 37, 2005, 292-296.