Adam Babiarz Weronika Brzeźnak	Ćw. 6 ENZYMY	OGRODNICTWO I rok Grupa I / zespół E

6.4 Peroksydaza

Listek brukselki rozgniatamy w moździerzu, najpierw z 2cm³ a potem z 18cm³ buforu octowego. Następnie przesączamy do 2 próbówek po 2cm³. Jedną z nich doprowadzamy do wrzenia. Do obu dodajemy kilka kropel 3% H₂O₂ i pirogalolu.

W próbówce ogrzewanej pojawił się kolor żółty.

W próbówce nieogrzanej pojawił się kolor brązowy.

W próbówce ogrzanej jest kolor żółty, ponieważ brukselka zawiera dużo białka, które pod wpływem wysokiej temperatury ścina się i enzym, który powoduje ciemnienie warzywa, staje się nieaktywny. W próbówce nieogrzewanej pozostaje aktywny.

6.5 Katalaza

Z ziemniaka wycinamy 2 walce. Jeden z nich umieszczamy w gorącej wodzie. Następnie umieszczamy je w próbówek i wlewamy po 5cm³ 0,01% H₂o₂ oraz 1 cm 3% H₂O₂.

W próbówce z ziemniakiem surowym wydzielają się bąbelki.

W próbówce z gotowanym nic się nie wydziela.

Katalaza to enzym, który rozkłada nadtlenek wodoru H₂O₂ na tlen i wodę. Katalaza ulega zniszczeniu pod wpływem wysokiej temperatury. Dlatego w surowym ziemniaku wydzielają się bąbelki.

6.6 Oksydaza polifenolowa

Z ziemniaka wycinamy 9 plastrów, 2 umieszczamy w gorącej wodzie. Następnie układamy na tacy i nanosimy po kilka 1% pirogalolu, 2 % fenolu H­­­₂o, 10% NaCl, 5% CuSO₄.

Na Ziemniakach z 1% pirogalolu pojawiła się brązowa barwa. Ziemniak z dodatkiem 2% fenolu i 5% CuSO₄­ zmienił barwę na niebieską. Ziemniak z 10% NaCl i 2%fenolem zabarwił się na lekki róż Na Ziemniaku z H₂O nic się nie zmieniło. Tak samo ziemniaki ugotowane nie zmieniły barwy.

Kolor brązowy otrzymujemy dzięki produktowi reakcji utlenienia pirogalolu. Fenol, również ulega utlenieniu, przez co ziemniaki skropione fenolem zabarwiły się na różowo.
Oksydaza polifenolowa jest aktywowana przez CuSO4 i w obecności pirogalolu i fenolu uaktywnia całą reakcję, przez co zachodzi ona szybciej.

8.1 Wyznaczanie stałej Michaelisa-Mentena (Km)

Do 6 probówek dodajemy odpowiednie ilości roztworów. Następnie wstawiamy je do termostatu i po 5min dodajemy enzymu i znowu wkładamy do termostatu. Po 10min dodajemy węglan sodu. Oznaczamy absorbancje.

Nr próbówki	Stężenie substratu	Stężenie uwolnionego 4-nitrofelonu [mol * dm^-3]	Szybkość uwalniania 4-NP.
	[mol * dm^-3]
	S	1/S	Absorbancja
1	0,0003	3333,333	0,08
2	0,0006	1666,667	0,11
3	0,0009	1111,111	0,13
4	0,0012	833,3333	0,31
5	0,0015	666,6667	0,34

y = 188,15x + 102256
y=0
0=188,15x + 102256 -102256=188,15 -1/Km = x = -543,481 -1 = Km * (-543,481) Km = 0,00183999~= 1,84 *10^-3

Vmax=1/102256
Vmax=9,78*10^-6

8.2. Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji

Nr próbówki	1	2	3	4	5
Ilość enzymu [cm^3]	0,5	1	1,5	2	2,5
Absorbancja	0,04	0,31	0,58	0,8	0,87
Stężenie uwolnionego 4-NP [mol * dm^-3]	7,29687*10^-6	5,65508*10^-5	10,6*10^-5	14,6*10^-5	15,9*10^-5

W miarę wzrostu stężenia substratu szybkość reakcji rośnie, osiągając maksymalną wydajność wtedy gdy wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z substratem. Tak więc w miarę zwiększania się stężenia substratu wysycenie centrów aktywnych enzymu stopniowo wzrasta i przy pełnym wysyceniu szybkość osiąga swe maksimum. Dalsze zwiększanie ilości substratu nie powoduje zwiększenia szybkości reakcji, może nawet ją zmniejszyć nieznacznie. 

8.3 Przygotowanie krzywej wzorcowej dla 4-nitrofenolu.

Do 6 próbówek należy dodać 0,2*10^-3 mol dm^-3 roztworu 4-NP. Następnie do wszystkich dodajemy 2,5cm³ węglanu sodu i oznaczamy absorbencja.

Nr próbówki	Stężenie 4-NP	Absorbancia
1	0,00004	0,24
2	0,00008	0,51
3	0,00012	0,7
4	0,00016	0,8
5	0,0002	1,1

Funkcja liniowa y = 5481,8x