Ćwiczenie I - Amfoteryczny charakter aminokwasów

TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

1. Wstęp teoretyczny.

Doświadczenie 1 - Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

Punkt izoelektryczny- odpowiada takiej wartości pH, przy której sumaryczny ładunek cząsteczki jest równy zero. W punkcie izoelektrycznym białko lub aminokwas charakteryzuje się brakiem ruchu w polu elektrycznym. Wyznaczenie pI jest ważnym elementem opisu białka. Najbardziej precyzyjną metodą wyznaczania pI jest metoda izoelektroogniskowania. Jest to technika elektroforetyczna polegająca na rozdziale białek zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi podczas wędrówki w polu elektrycznym w żelu. Żel został tak przygotowany, że posiada liniowy gradient pH.

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny. Kazeina jest najważniejszym białkiem w mleku ssaków. Stanowi ona około 3/4 wszystkich białek zawartych w mleku.

Doświadczenie 2 - Krzywe miareczkowania aminokwasów

Aminokwasy mają charakter amfoteryczny. Wskazuje na to ich budowa- posiadanie grupy aminowej i karboksylowej. W roztworach aminokwasów panuje równowaga wystepowania wszystkich form jonowych aminokwasów. Wartość pH determinuje, których form będzie więcej, a których mniej w roztworze.

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie krzywej miareczkowania kwasu asparaginowego. Trzeba zaznaczyć, że wartośc pH nie zmienia się proporcjonalnie wraz z dodawaniem roztworu miareczkującego. W pobliżu wartości pK obserwuje się mniejsze zmiany wartości pH. Spowodowane jest to właściwościami buforującymi roztworu aminokwasu.

Kwas asparaginowy jest aminokwasem o charakterze kwasowym. W skład jego cząsteczki wchodzą dwie grupy karboksylowe i grupa aminowa. To właśnie przewaga grup karboksylowych determinuje taki, a nie inny charakter aminokwasu.

Kwas asparaginowy

2. Materiały

Odczynniki:

- 1 M NaOH

- 1 M HCl

- wodny roztwór aminokwasu: 0,05 M kwas asparaginowy

- 1 M kwas octowy

- 0,1 M CH₃COONa zawierający kazeinę w końcowym stężeniu 0,2%

- bufory wzorcowe do kalibracji pehametru o pH 4,01 ; 7,01 ; 9,18

Szkło i aparatura:

- probówki chemiczne na 20 ml i na 5 ml

- pipety automatyczne oraz tipsy

- pipety szklane

- cylinder miarowy

- zlewki o pojemności 50 ml

- mieszadło magnetyczne

- mieszadełka magnetyczne małe i duże

- pehametr laboratoryjny z elektrodą

3. Pomiary

Miareczkowania wody

ΣVHCl [ml]	pH
0	5,00
0,01	3,64
0,02	3,33
0,03	3,15
0,06	2,84
0,09	2,67
0,12	2,54
0,17	2,40
0,23	2,27
0,31	2,14
0,41	2,02
0,53	1,92
0,65	1,83
0,77	1,76
0,89	1,70
1,1	1,64
1,2	1,61
1,3	1,57
1,4	1,54
1,47	1,51
1,5	1,50
ΣVNaOH [ml]	pH
0	6,29
0,01	10,30
0,02	10,64
0,03	10,82
0,04	10,97
0,09	11,30
0,14	11,50
0,25	11,73
0,35	11,88
0,45	11,97
0,65	12,04

Miareczkowania kwasu asparaginowego

pH	VHCl [ml]	VH2O [ml]	b-c	ntittranta/naa
a	b	c	d	e
2,94	0	0	0	0
2,91	0,02	0,02	0	0,01
2,84	0,04	0,04	0	0,03
2,79	0,04	0,04	0	0,05
2,68	0,08	0,08	0	0,09
2,58	0,08	0,08	0	0,13
2,49	0,08	0,08	0	0,17
2,41	0,08	0,08	0	0,21
2,33	0,08	0,08	0	0,25
2,26	0,08	0,08	0	0,29
2,20	0,08	0,08	0	0,33
2,14	0,08	0,08	0	0,37
2,09	0,08	0,08	0	0,41
2,04	0,08	0,08	0	0,45
1,98	0,1	0,1	0	0,5

pH	VNaOH [ml]	VH2O [ml]	b-c	ntitranta/naa
b	a	c	d	e
2,93	0	0	0	0
3,09	0,1	0,05	0,05	0,05
3,22	0,1	0,04	0,06	0,1
3,51	0,2	0,08	0,12	0,2
3,65	0,1	0,06	0,04	0,25
3,91	0,2	0,15	0,05	0,35
4,06	0,1	0,06	0,04	0,4
4,24	0,1	0,06	0,04	0,45
4,46	0,1	0,07	0,03	0,5
4,80	0,1	0,07	0,03	0,55
6,36	0,1	0,07	0,03	0,6
8,75	0,1	0,07	0,03	0,65
9,11	0,1	0,08	0,02	0,7
9,34	0,1	0,08	0,02	0,75
9,52	0,1	0,08	0,02	0,8
9,66	0,1	0,08	0,02	0,85
9,80	0,1	0,09	0,01	0,9
9,94	0,1	0,09	0,01	0,95
10,07	0,1	0,09	0,01	1,0
10,23	0,1	0,09	0,01	1,05
10,40	0,1	0,1	0	1,1
10,62	0,1	0,1	0	1,15
10,90	0,1	0,1	0	1,2

pK grup funkcyjnych

titrant: HCl ; aminokwas: asparaginian

ntitranta	naa	pH
0	0,05	2,94
0,0004997	0,04997	2,91
0,001498	0,04992	2,84
0,002494	0,04987	2,79
0,004480	0,04978	2,68
0,006458	0,04968	2,58
0,008428	0,04958	2,49
0,01039	0,04948	2,41
0,01235	0,04938	2,33
0,01429	0,04928	2,26
0,01623	0,04919	2,20
0,01816	004909	2,14
0,02009	0,04900	2,09
0,02200	0,04890	2,04
0,02439	0,04878	1,98

titrant: NaOH ; aminokwas: asparaginian

ntitranta	naa	pH
0	0,05	2,93
0,002494	0,04987	3,09
0,004975	0,04975	3,22
0,009901	0,04950	3,51
0,01235	0,04938	3,65
0,01720	0,04914	3,91
0,01961	0,04902	4,06
0,02200	0,04890	4,24
0,02429	0,04878	4,46
0,02676	0,04866	4,80
0,02913	0,04854	6,36
0,03148	0,04843	8,75
0,03382	0,04823	9,11
0,03614	0,04819	9,34
0,03846	0,04808	9,52
0,04077	0,04796	9,66
0,04306	0,04785	9,80
0,04535	0,04773	9,94
0,04762	0,04762	10,07
0,04988	0,04751	10,23
0,05213	0,04739	10,40
0,05437	0,04728	10,62
0,05660	0,04717	11,90
0,05882	0,04706	11,95
0,06103	0,04695	12,00

$$pK = pH - log\left( \frac{\left\lbrack \text{zasada} \right\rbrack\lbrack H^{+}\rbrack}{\lbrack kwas\rbrack} \right)$$

$$pK = 2,91 - log\left( \frac{0,04997}{0,0004997} \right) = 0,91$$

titrant: HCl ; pK dla asparaginianu titrant: NaOH ; pK dla asparaginianu

1,79
2,22
2,81
3,05
3,45
3,66
3,89
4,16
4,54
6,14
8,56
8,95
9,21
9,42
9,59
9,75
9,92
10,07
10,25
10,44
10,68
10,98
11,31
11,56
11,75
11,88
11,98
12,08
12,14
12,20

0,91
1,32
1,49
1,63
1,69
1,72
1,73
1,73
1,72
1,72
1,71
1,70
1,69
1,68

Obliczając pK grup funkcyjnych w aminokwasie wyliczam średnią wartość

pK₁=1,72

pK₂=9,93

pK₃=3,79

Na podstawie obliczonych pK można wyznaczyć pI dla asparaginianu:

$$pI = \frac{pK_{1} + pK_{3}}{2} = \frac{1,72 + 3,79}{2} = 2,76$$

PB₁= 1,22 - 2,22

PB₂= 9,43 - 10,43

PB₃= 3,29 - 4,29

pK	pK1	pK2	pK3	pI
doświadczalne	1,72	9,93	3,79	2,76
literaturowe	2,0	10,0	3,9	2,95

Metoda wykorzystana do obliczenia wartości pK i pI aminokwasu sprawdza się co obrazują otrzymane wartości. Są one bardzo zbliżone do literaturowych, a delikatne różnice pomiędzy wynikami doświadczalnymi a literaturowymi można tłumaczyć niewielkim zanieczyszczeniem roztworów lub nie w pełni sucha elektrodą, która mogła przyczynić się do dodatkowego rozcieńczenia roztworów.

Badanie punktu izoelektrycznego kazeiny

	2,53	2,73	2,87	3,03	3,22	3,39	3,54	3,70	3,72
zmętnienie	-	-	+	++	+++	++	+	-	-
osad	-	-	+	++	++	+	+	-	-

Na podstawie powyższej tabeli można uzyskać informacje na temat punktu izoelektrycznego kazeiny. Największe zmętnienie roztworu i wytracenie osadu zaobserwowani w próbce nr 5. pH roztworu tej próby wynosi 3,22 i ta wartość oznacza szukany pI. Jest to wartość znacznie niższa od literaturowej, która kształtuje się w przedziale 4,0-5,0. Zastosowana metoda jest zbyt ogólna i pozwala nam jedynie z pewną dokładnością wyznaczyć punkt izoelektryczny. Innym powodem odnotowania zbyt niskiej wartości może być zanieczyszczenie przygotowywanych roztworów lub zawiodła percepcja.