1. Czym różnią się ustalona linia komórkowa od ciągłej linii komórkowej?

   Ustalona l.kom.- ustalona liczba podziałów po której komórka obumiera (skracanie telomerów), komórki diploidalne;

Ciągła l.kom. – nieokreślona liczba podziałów, komórki najczęściej poliploidalne, pochodzenia nowotworowego. Ciągłą linię komórkową można także uzyskać z komórek prawidłowych w wyniku ich transformacji lub transfekcji, np. SV40, czyli zmiany materiału genetycznego.

1. Jaki typ hodowli poprowadzisz w celu uzyskania jak największej wydajności ilościowej komórek zwierzęcych rosnących w postaci monowarstwy. Uzasadnij.

   Zastosowałbym hodowlę komórkową na mikronośnikach, np. kuleczki powlekane kolagenem. Dzięki temu zwiększona zostanie powierzchnia wzrostu komórek.

2. Chcesz zamrozić komórki białaczkowe linii HL60. Jakie warunki powinna spełniać hodowla, by uniknąć strat podczas przechowywania? Wiedząc, że DMSO indukuje proces różnicowania w tych komórkach zaproponuj, który z krioprotektantów zastosujesz.

→ Aby uniknąć strat podczas przechowywania, zamrażane komórki muszą być w fazie log wzrostu, muszą być w dobrej kondycji i muszą być wolne od mikroorganizmów.

→ Jako krioprotektant zastosuję glicerol, ponieważ jest mniej toksyczny niż DMSO.

Krioprotektant: substancja działająca ochronnie na komórki, bez niego większość komórek jest skazana na śmierć.

DMSO: dimetylosulfotlenek.

1. Wymień cechy biomateriałów. Podaj przykład terapeutycznego zastosowania biomateriałów.

→ Cechy biomateriałów:

- wolne od detetrminant białkowych mogących przenosić różnego rodzaju choroby (nie indukuje powstania odpowiedzi immunologicznej)

- możliwe największe podobieństwo materiału do naturalnej tkanki warunkujące przyjęcie wszczepu przez organizm

- resorpcja biomateriału przez organizm (wchłanianie)

- biomateriał zawsze musi być pokrywany membraną (ochrona przed wrastaniem nabłonka).

→ Przykład terapeutycznego zastosowania biomateriału: wszczepianie bioobojętnych materiałów, na przykład polimerów ulegających biodegradacji i implantów tytanowych lub ceramicznych jako wzmocnienie lub rusztowanie dla odbudowującej się tkanki kostnej.

Biomateriały: szkielety polimerowe do adhezji, namnażania i różnicowania komórek, najlepiej, jeżeli są to biodegradowalne polimery, na przykład chityna, kwas hialuronowy, kolagen, żelatyna.

1. Wyjaśnij co to jest potworniak i kiedy jest tworzony?

   → Jest to nowotwór, będący wynikiem patologicznych zmian zachodzących w komórce zarodkowej. Taka komórka różnicuje się w kierunku elementów trzech listków zarodkowych, czyli wczesnego embrionalnego rozwoju dziecka. Potworniak stanowi mieszankę rozmaitych tkanek. Najczęściej przyjmuje postać torbieli skórzastej (odmiana potworniaka dojrzałego). Twór stopniowo się powiększa i zawiera wykształcone włosy, paznokcie i czasem zęby. Zawiera także gruczoły łojowe i potowe, czasem wytwarza hormony, które wywołują zaburzenia hormonalne.

2. Wyjaśnij pojęcie pierwszej dawki toksycznej.

   EC10- stężenie związku przy którym proliferacja komorek w hodowli in vitro zostaje zahamowana w 10% w stosunku do komorek kontrolnych.

3. Co to jest limit Hayflicka? W jakim celu i w jaki sposób można zwiększyć jego wartość?

   Limit hayflicka jest to max liczba podziałów komórki, po której komórka ta obumiera. Zwiększyć limit ten można poprzez indukowanie ekspresji telomerazy, co prowadzi do unieśmiertelnienia komórki. W ten sposób otrzymujemy linię ciągłą-zapobiegamy obumieraniu komórek.

4. Przeprowadzono eksperyment (pomiar absorbancji), w którym badano wpływ rotenonu na proliferację komórek. Uzyskano następujące wyniki:

   OD 590nm dla kontroli (komórki bez związku): 1,0

   OD 590nm dla komórek potraktowanych rotenonem 1µM: 1,000

   OD 590nm dla komórek potraktowanych rotenonem 10µM: 0,001

   Wyznacz wartość przeżywalności komórek dla obydwu stężeń rotenonu oraz IC50 dla rotenonu.

5. Co to są priony? Wskaż potencjalne źródło oraz skutki zakażenia hodowli prionami.

   Priony są to białkowe cząsteczki infekcyjne. Źródłem zakażenia może być surowica, wolne od BSE są surowice nowozelandzka i australijska. Surowice innego pochodzenia geograficznego muszą być testowane. Skutkiem zakażenia hodowli prionami jest destrukcja komórek.

6. Wskaż czym różni się podłoże kondycjonowane od podłoża głodzącego i kiedy je stosujemy.

   Podłoże głodzące- 1% FBS, zmniejsza tempo wzrostu i proliferacji, pozwala poprzez stres komórkowy indukować ekspresję określonych białek, np. receptorów. Należy dodać substancje zastępcze: albuminy i alfa-globuliny, czynniki wzrostu, hormony;
   Podłoże kondycjonowane- pożywka w której uprzednio rosły konfluentne komórki danej linii i wydzieliły do niej substancje stymulujące wzrost. Pożywki te stymulują wzrost i proliferację.

7. Wymień typy białek adhezyjnych i wskaż, które z nich łączą się z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, a które tworzą połączenia homofilne.

   Białka adhezyjne-białka uczestniczące w przyleganiu komórek do siebie.

   Należą do nich integryny, selektyny oraz kadheryny.

Z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej łączą się integryny.

Połączenia homofilne tworzą kadheryny sąsiadujące.

1. Narysuj krzywą wzrostu charakteryzującą linię komórkową, wskaż fazy wzrostu oraz nanieś (z zaznaczeniem) na wykresie krzywą wzrostu dla komórek o większym tempie proliferacji.

   

   

Komórki nowotworowe, szybko proliferujące mają krzywą bardziej stromą i wysoką.

1. Prowadzisz hodowlę komórek HepG2 w podłożu DMEM, które w warunkach prawidłowych ma czerwoną barwę. Następnego dnia po pasażowaniu komórek zaobserwowałeś znaczne zmętnienie podłoża oraz jego zażółcenie. Wytłumacz co mogło się zdażyć i w jaki sposób zmniejszyć negatywne skutki tego zdarzenia.

   Po pasażowaniu komórek prawdopodobnie doszło do zmiany pH . Zmniejszenie negatywnych skutków tego zdarzenia:

   -wyeliminowanie możliwości zakażenia

   -bardziej sterylne warunki

   -zachowanie optymalnej temperatury

   Indykator w podłożu indykator pH, czerwień fenolowa

   pH kwasowe 6,8 żółty(pasażowanie w tempie natychmiastowym).

2. Wskaż kiedy dokonasz zmiany medium hodowlanego i dlaczego.

   Hodowla komórek w warunkach In vitro powoduje nagromadzenie się metabolitów(często toksycznych) w pożywce, które wpływają na zmianę pH pożywki.

   Większośc komórek przestaje rosnąc przy spadku pH do wartości 7-6,5.

   Spadek przeżywalności następuje przy pH 6,5-6

   Jeśli medium zmienia kolor z czerwonego po przez pomarańczowy do żółtego należy je zmienic

   Trzeba oszacowac tempo spadku pH podłoża hodowlanego dla danej linii komórkowej.

   Jeśli dla danej kultury występuje spadek pH o 0,1/dzień to przetrzymanie hodowli o 1-2 dni nie wpłynie na komórki negatywnie. Jeżeli natomiast spada w tempie 0,4 jednostki na dzień to hodowla musi mieć zmienione medium co 24-48h.

3. Analizując poniższe dane wskaż, który ze związków jest bardziej efektywny biologicznie wobec komórek HT29 oraz która z linii komórkowych jest bardziej oporna na działanie związku B.

Typ komórek	Związek A	Związek B
HL60	EC50= 0,5mg/L	EC50= 1,5mg/L
HT29	EC50= 1,5mg/L	EC50= 0,5mg/L

1. Czym różni się aktywność cytotoksyczna związku od aktywności cytostatycznej? W jaki sposób je zmierzysz?

   Cytotoksyczność- toksyczność na poziomie komórkowym określenie to oznacza szeroko pojętą toksyczność różnych substancji i różnego rodzaju komórek względem komórek w danym organizmie. Cytotoksyczność może być bardziej precyzyjnie określona, przez podanie w nazwie typu komórek, na który działa dany czynnik. Przykładowo, nefrotoksyczność oznacza toksyczne oddziaływanie danej substancji (zwykle leku) na komórki nerek, a neurotoksyczność na komórki nerwowe. Cytostatyczność Ogólna zasada działania cytostatyków polega na zaburzaniu cyklu komórkowego i powodowaniu śmierci komórki lub zahamowaniu jej rozwoju i podziałów związki hamujące podziały komórek. Stosowane są najczęściej w terapii przeciwnowotworowej. Mają wiele działań ubocznych bardzo szkodliwych dla organizmu np.: hamują podziały komórekszpiku kostnego, co z kolei prowadzi do niedokrwistości, znacznego upośledzenia odporności (leukocyty) i krzepnięcia krwi (płytki krwi). Zmierzyć można za pomocą testów biologicznych (tu chyba trzeba podać jeden z tych notatek ale nie jestem pewna) do pyt 16: dla aktywności cytotoksycznej badamy aktywność enzymatyczną czyli za pomocą testów mtt, presto blue, ldh a cytostatyczną badając proliferację czyli za pomocą brdu, cyquant fiolet krystaliczny i sulforodaminy

2. Czym różni się sferoid od skafoldu?

   Skafold-macierz (szkielet, matryca). Podobna funkcja do funkcji naturalnej ECM: podporowa – stanowi rusztowanie dla komórek, stymuluje proliferację, różnicowanie i biosyntezę w komórce, chroni uszkodzone miejsce przed infekcją i dalszymi uszkodzeniami. Sferoid -powstaje z agregatów ( mogą być zbudowane z jednego lub kilku typów komórek, zawierają macierz zewnątrzkomórkową i połączenia zewnątrzkomórkowe), które w czasie hodowli przekroczyły krytyczną średnicę agregatu. Rosnące w systemie 3D sferoidy zachowują się jak guzy

3. Opisz i wyjaśnij na czym polega proces reprogramowania komórek (podaj przykład) oraz skaż czynniki transkrypcyjne warunkujące ten proces.

   Reprogramowanie to procedura przeprowadzenia komórek somatycznych w pluripotentne. Geny wprowadzono za pomocą lentiwirusów jako ORF ( nie ma intronów), wysoka wydajność transdukcji oraz zapobieganie utracie DNA przy podziale kom. dzięki integracji lentowirusów. - to znalazłam w necie i za to Nobla dostali dwaj naukowcy: Yamanaka uzyskał to w ten sposób, że wprowadził do komórki zróżnicowanej cztery geny kodujące - tzw. czynniki transkrypcyjne ( Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) czyli białka regulujące ekspresję wielu różnych genów. To są czynniki transkrypcyjne, które oczywiście Yamanaka musiał jakoś zidentyfikować. Te czynniki w tej chwili są określane jako tzw. Koktajl Yamanaki i dzięki aktywności tych genów, które w naszych dorosłych komórkach już nie są aktywne, dzięki ich aktywności w komórkach zróżnicowanych, te komórki mogą się cofnąć do wcześniejszego stadium odpowiadającego komórkom embrionalnym, macierzystym.

4. Co to jest macierz pozakomórkowa? Wymień jej główne składniki oraz wskaż jej znaczenie w warunkach hodowli in vitro wraz z przykładem.

   Macierz pozakomórkowa (ECM) – to dynamiczna, elastyczna i wielkoskładnikowa zwarta struktura, która wypełnia przestrzeń między komórkami, gdzie dochodzi do magazynowania czynników wzrostu i cytokin oraz przenoszenia sygnałów. Składa się z różnych glikoproteidów i proteoglikanów w stosunku swoistym dla każdej tkanki. W hodowli in vitro ECM umożliwia przyczepienie się komórek do szkła lub plastiku, rozpłaszczenie się, podział i różnicowanie.

   Przykładem jest zastosowanie warstwy porowatego kolagenu przy regeneracji skóry.

5. Biorąc pod uwagę parametr, jakim jest temperatura, wskaż w jaki sposób powinno przebiegać uruchomienie hodowli z krioprobówki zawierającej komórki przechowywane w ciekłym azocie.

   Rozmrażanie powinno przebiegać możliwie jak najszybciej. Po wyjęciu z banku ampułki umieszcza się w temp. 37 o C na 60-90 s. Zapobiega to mechanicznemu uszkodzeniu komórek związanemu ze zjawiskiem wtórnego rozrastania się kryształów lodu podczas rehydratacji. W momencie rozpuszczania zawartości, przenosi się ją z krioprobówki do dużej objętości ogrzanej pożywki ( i do inkubacji). Można zwirować komórki ( 150g, 5 min), co pozwali na odpłukanie toksycznych związków, a następnie zawiesić komórki w świeżym podłożu.