Akademia Górniczo-Hutnicza
Kierunek:
Nazwisko i Imię
Temat ćwiczenia:
Data wykonania ćwiczenia:
17.04.2015

1. Izolacja peroksydazy z korzenia chrzanu

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczeń laboratoryjnych było wyizolowanie enzymu peroksydazy z korzenia chrzanu, który to wykorzystany został w kolejnym ćwiczeniu.

1. Materiały i sprzęt laboratoryjny

• Korzeń chrzanu

• waga techniczna

• próbówki typu falkon 15 ml

• moździerz

• tarka

• nóż

• wirówka

• pipeta

1. Odczynniki chemiczne

• Bufor fosforanowy 25mM o pH równym 6,5

• Aceton

1. Przebieg doświadczenia

1. Na tarce starto obrany korzeń chrzanu, a następnie odważono ok. 5g i przeniesiono do moździerza.

2. Bufor fosforanowy o stężeniu 0,1M rozcieńczono 4 razy do stężenia 25mM.

3. Do odważonego chrzanu dodano 15 ml 25mM buforu fosforanowego i  utarto
   w moździerzu.

4. Zebrano pipetą powstały roztwór znad pozostałości tkanek, zawierający peroksydazę oraz przelano go do falkonu.

5. Falkon umieszczono w wirówce na 5 minut z prędkością obrotową 3000 rpm.

6. Wyjęto próbkę i zlano supernatant, a osad, który zawierał białka umieszczono
   w zamrażalce na ok. 2 minuty.

7. Wyjęto próbkę z zamrażalki i dodano aceton w ilości równej czterem objętościom ekstraktu znajdującego się na dnie probówki i wstrząsano energicznie do wytrącenia osadu.

8. Otrzymany roztwór umieszczono w wirówce na okres 15 minut ( prędkość obrotowa 10000 rpm).

9. Po wyjęciu z wirówki ponownie zlano supernatant, a pelety zawieszono w 2 ml 25 mM buforu fosforanowego.

1. Wnioski

Aby prawidłowo wyizolować peroksydazę z chrzanu potrzebne jest zachowanie odpowiedniego pH mieszczącego się w przedziale od ok. 5 do 7 (w doświadczeniu użyto buforu fosforanowego o pH = 6,5). W takim przedziale pH peroksydaza jest najbardziej aktywna. Równie istotnym czynnikiem wpływającym na stopień aktywności enzymu jest temperatura. Mimo, iż peroksydaza jest enzymem mało wrażliwym na wysoką temperaturę, to znaczny jej wzrost wpływa na obniżenie aktywności tego enzymu.

1. Test obecności peroksydazy w tkankach

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było stwierdzenie, które z badanych tkanek zwierzęcych i roślinnych są najbogatszym źródłem enzymu z grupy oksyreduktaz – peroksydazy.

1. Sprzęt laboratoryjny i materiały

• fragmenty organów roślinnych i zwierzęcych

• chrzan (korzeń)

• chrzan (wyizolowana peroksydaza)

• sałata (liść)

• brokuł (łodyga)

• skóra z kurczaka

• wątroba zwierzęca

• żółtko jaja kurzego

• 8 probówek szklanych

• 8 plastikowych probówek typu eppendorf – 2ml (oraz 8 dodatkowych probówek szklanych pełniących rolę statywu dla probówek plastikowych)

• statyw

• deska do krojenia i nóż

1. Odczynniki

• 3% roztwór nadtlenku wodoru

• woda dejonizowana

1. Przebieg doświadczenia

1. Ustawiono 8 szklanych i 8 plastikowych probówek typu eppendorf w odpowiednio przygotowanym statywie.

2. Wycięto z elementów organów zwierzęcych i roślinnych po 2 fragmenty próbek.

3. Umieszczono po 2 ml 3% nadtlenku wodoru w probówkach szklanych i po 1 ml 3% nadtlenku wodoru w probówkach plastikowych typu eppendorf.

4. Przygotowano próbę ślepą poprzez umieszczenie w jednej probówce szklanej i jednej probówce plastikowej typu eppendorf kolejno 2ml i 1 ml wody dejonizowanej, a także odpowiednio 2 ml i 1 ml 3% nadtlenku wodoru.

5. W sześciu szklanych probówkach z 3% nadtlenkiem wodoru umieszczono fragmenty tkanek, w probówce siódmej, również zawierającej 3% nadtlenek wodoru umieszczono
   1 ml wyizolowanej w poprzednim doświadczeniu peroksydazy.

6. W sześciu plastikowych probówkach typu eppendorf zawierających 3% nadtlenek wodoru umieszczono fragmenty tkanek, w probówce siódmej, również zawierającej 3% nadtlenek wodoru umieszczono 1 ml wyizolowanej w poprzednim doświadczeniu peroksydazy, eppendorfki szczelnie zamknięto.

7. Obserwowano przebieg i intensywność reakcji.

1. Obserwacje

W wyniku umieszczenia w probówkach i eppendorfach różnych rodzajów tkanek, zawierających enzym – peroksydazę oraz roztworu nadtlenku wodoru, doszło do reakcji utlenienia, która objawiła się:

- w przypadku próbek umieszczonych w probówkach : wydzieleniem się pęcherzyków gazu, powstanie piany w górnej części roztworu z tkanką;

- w przypadku próbek umieszczonych w probówkach typu eppendorf : gwałtowna reakcja, nadmiar gazu uwięzionego w szczelnie zamkniętych eppendorfach spowodował ich odrzucenie w powietrze, ‘’wystrzelenie’’ korków probówek oraz znajdujących się wewnątrz tkanek.

W zależności od rodzaju tkanki, czas reakcji był różny.

1. Wnioski

We wszystkich probówkach zaobserwowano pojawienie się pęcherzyków powietrza co oznaczało wydzielanie się tlenu. Wśród probówek szklanych kolejność zajścia reakcji były następująca dla próbek z: wątrobą zwierzęcą, skórą z kurczaka, łodygą brokułu, korzeniem chrzanu, liściem sałaty, peroksydazą wyizolowaną z chrzanu, a na końcu z żółtkiem jaja kurzego. W plastikowych probówkach typu eppendorf kolejność była nieco inna: wątroba zwierzęca, skóra z kurczaka, korzeń chrzanu, łodyga brokułu, liść sałaty, peroksydaza wyizolowana z chrzanu i żółtko jaja kurzego.

Badanie pokazuje, że peroksydaza znajdująca się w różnych rodzajach tkanek wykazuje odmienną aktywność. Zarówno wśród próbek umieszczonych w szklanych probówkach, jak i zamkniętych eppendorfach, największą aktywnością wykazała się, a co za tym idzie, największa jej ilość znajdowała się w tkankach zwierzęcych (wątroba, skóra z kurczaka), następnie w tkankach roślinnych (korzeń chrzanu, łodyga brokułu, liść sałaty), w mniejszym stopniu w żółtku jaja kurzego.

Różnice polegające na rozbieżnościach między próbkami umieszczonymi w szklanych probówkach i eppendorfach mogą wynikać z wielkości użytych próbek tkanek, a także innych niedokładności
w przeprowadzaniu doświadczenia.