TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter białek i aminokwasów

1. Wstęp:

Krzywe miareczkowania aminokwasów

Aminokwasy mają charakter amfoterycznych. Posiadają grupy aminowe zdolne do włączania protonu oraz grupy karboksylowe zdolne do oddysocjowania protonu. Dodatkowe łańcuchy boczne mogą ulegaj rożniej jonizacji. W roztworze cały czas panuje rownowaga pomiędzy wszystkimi formami jonowymi. W zależności od pH jednych form jonowych jest więcej, nich mniej. Celem ćwiczenia jest wyznaczenie krzywych miareczkowania dla dwoch aminokwasow. Jest to zależność zmiany pH od ilości dodawanego kwasu lub zasady. Wartość pH nie zmienia się jednostajnie. Dla wartości pH zbliżonych do pK zmiany pH są małe. Mechanizm ten zwany buforowaniem polega na przesuwaniu rownowagi przeciwnie do zmian pH. Gdy dodawany jest kwas rownowaga jest przesuwana w stronę formy niezdysocjowanej tak, aby związać nadmiar jonow wodorowych. Dla wartości pH zbliżonych do pI zmiany pH są duże.

Alanina, prosty α-aminokwas, jeden z dwudziestu standardowych aminokwasów białkowych. Za jej pojawienie się w łańcuchu polipeptydowym odpowiada obecność kodonów GCU, GCC, GCA lub GCG w łańcuchu mRNA.

Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

Punkt izoelektrycznych (pI) to pH dla ktorego aminokwas/białko posiada sumaryczny ładunek elektryczny rowny zero. Wowczas cząsteczka taka cząsteczka nie porusza się w polu elektrycznym. Precyzyjną metodą wyznaczenia pI jest izoelektroogniskowanie. Polega na przyłożeniu napięcia do płytki żelowej z naniesionym białkiem. Żel został tak przygotowany, że posiada liniowy gradient pH. Białko zatrzyma się, gdy będzie nienaładowane, czyli dokładnie w pI. Inna metodą jest wytrącanie osadow. Białko w pI posiada najmniejszą rozpuszczalność. Sporządza się serię roztworow o rożnych pH i rozpuszcza się w nich białko. Punkt izoelektrycznych białka jest rowny pH roztworu, gdzie wytrącił się największy osad. Jest to metoda szybsza i łatwiejsza do wykonania, jednak mniej dokłada.

Celem doświadczenia jest wyznaczenie pI kazeiny przez wytrącenie osadu. Kazeina jest kwaśnym białkiem wyizolowanym z mleka ssakow. Pełnia ona funkcje stabilizujące w mleku, czyli roztworze koloidowym tłuszczu w wodzie. Punkt izoelektryczny kazeiny wynosi od 4,5 do 4,7 w zależności od użytej metody jej izolacji.

1. Materiały:

Odczynniki:

- 1 M NaOH

- 1 M HCl

- wodny roztwór aminokwasu: 0,05 M kwas asparaginowy

- 1 M kwas octowy

- 0,1 M CH₃COONa zawierający kazeinę w końcowym stężeniu 0,2%

- bufory wzorcowe do kalibracji pehametru o pH 4,01 ; 7,01 ; 9,18

Szkło i aparatura:

- probówki chemiczne na 20 ml i na 5 ml

- pipety automatyczne oraz tipsy

- pipety szklane

- cylinder miarowy

- zlewki o pojemności 50 ml

- mieszadło magnetyczne

- mieszadełka magnetyczne małe i duże

- pehametr laboratoryjny z elektrodą

1. Cel doświadczenia:

Wykonanie krzywych miareczkowania dwóch aminokwasów, określenie ich punktów izoelektrycznych, pK grup funkcyjnych i przedziałów buforowania. Wyznaczenie pI kazeiny.

1. Przebieg doświadczenia:

1. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

- Wykalibrowaliśmy pehametr za pomocą wzorców pH: 4.01, 7.01 i 9.18

- Przygotowaliśmy 18 probówek.

- W pierwszych 9 probówkach przygotowaliśmy rozcieńczenia CH₃COOH wg schematu:

+ do 1. dodaliśmy 13,6 ml wody destylowanej i 6,4 ml 1M CH₃COOH.

+ do 2. dodaliśmy 5,0 ml wody destylowanej oraz 5,0 ml roztworu z probówki 1.

+ do 3-9 dodaliśmy 5,0 ml wody destylowanej oraz 5,0 ml roztworu z probówki ją poprzedzającej.

+ Objętości probówki 1 i 9 zmniejszono do 5 ml.

- Do mniejszych 9 probówek odmierzyliśmy odpowiednio 3ml przygotowanych rozcieńczeń.

- Zmierzyliśmy pH w probówkach. Tabela 5.

- Przelaliśmy roztwory z powrotem do probówek dużych.

- Do probówek dodaliśmy po 1 ml 0,5% roztworu kazeiny i wymieszaliśmy.

- Po 30min zanotowaliśmy wielkość zmętnienia i osadu. Tabela 5 .

1. Krzywe miareczkowania aminokwasów,

Miareczkowania wykonaliśmy na mieszadle magnetycznym.

- Wykalibrowaliśmy pehametr za pomocą wzorców pH: 4.01, 7.01 i 9.18

- Miareczkowaliśmy kontrolnie 40 ml wody destylowanej za pomocą 1 M HCl do pH 1,5. Tabela 1.

- Miareczkowaliśmy kontrolnie 40 ml wody destylowanej za pomocą 1 M NaOH do pH 13. Tabela 1.

- Miareczkowaliśmy 40 ml 0,05 M alaninę za pomocą 1 M HCl do pH poniżej 2. Tabela 2.

- Miareczkowaliśmy 40 ml 0,05 M alaninę za pomocą 1 M NaOH do pH 13. Tabela 3.

1. Pomiary:

∗ Miareczkowanie wody kwasem chlorowodorowym i wodorotlenkiem sodu. Tabela nr 1

L.p	pH	V HCl	L.p	pH	V NaOH
0,00	7,10	0,00	0,00	7,10	0,00
1,00	3,89	0,01	1,00	10,45	0,01
2,00	3,55	0,02	2,00	10,98	0,02
3,00	3,36	0,03	3,00	11,11	0,03
4,00	3,23	0,04	4,00	11,29	0,04
5,00	3,06	0,05	5,00	11,48	0,05
6,00	2,72	0,10	6,00	11,90	0,10
7,00	2,53	0,15	7,00	11,96	0,15
8,00	2,38	0,20	8,00	12,00	0,20
9,00	2,25	0,25	9,00	12,04	0,25
10,00	2,16	0,30	10,00	12,07	0,30
11,00	2,09	0,35	11,00	12,11	0,40
12,00	2,01	0,40	12,00	12,17	0,50
13,00	1,89	0,45	13,00	12,21	0,60
14,00	1,82	0,50	14,00	12,26	0,70
15,00	1,79	0,55	15,00	12,30	0,80
16,00	1,77	0,60	16,00	12,33	0,90
17,00	1,75	0,65	17,00	12,36	1,00
18,00	1,72	0,70	18,00	12,40	1,20
19,00	1,71	0,75	19,00	12,47	1,40
20,00	1,69	0,80	20,00	12,48	1,60
21,00	1,67	0,85	21,00	12,51	1,80
22,00	1,65	0,90	22,00	12,54	2,00
23,00	1,63	0,95	23,00	12,56	2,20
24,00	1,62	1,00	24,00	12,57	2,40
25,00	1,60	1,05	25,00	12,59	2,60
26,00	1,56	1,15	26,00	12,61	2,80
27,00	1,52	1,25	27,00	12,62	3,00
28,00	1,48	1,35

Wykres 1

∗Miareczkowanie Alaniny kwasem chlorowodorowym HCl Tabela nr 2

L.p	pH	Vtitranta Σ	Vtitranta H2O [ml]	Vaa [ml]	n titrant	naa	n titr/naa
0	6,29	0,00	0	0,00	0	0,004	0,000
1	5,21	0,01	0,01	0,00	0	0,004	0,000
2	4,86	0,02	0,01	0,01	0,00001	0,004	0,003
3	4,66	0,03	0,01	0,02	0,00002	0,004	0,005
4	4,53	0,04	0,01	0,03	0,00003	0,004	0,008
5	4,43	0,05	0,01	0,04	0,00004	0,004	0,010
6	4,07	0,10	0,05	0,05	0,00005	0,004	0,013
7	3,86	0,15	0,05	0,10	0,0001	0,004	0,025
8	3,68	0,20	0,05	0,15	0,00015	0,004	0,038
9	3,56	0,25	0,05	0,20	0,0002	0,004	0,050
10	3,45	0,30	0,05	0,25	0,00025	0,004	0,063
11	3,35	0,35	0,05	0,30	0,0003	0,004	0,075
12	3,36	0,40	0,05	0,35	0,00035	0,004	0,088
13	3,24	0,45	0,05	0,40	0,0004	0,004	0,100
14	3,16	0,50	0,05	0,45	0,00045	0,004	0,113
15	3,06	0,55	0,05	0,50	0,0005	0,004	0,125
16	3,02	0,60	0,05	0,55	0,00055	0,004	0,138
17	2,99	0,65	0,05	0,60	0,0006	0,004	0,150
18	2,96	0,70	0,05	0,65	0,00065	0,004	0,163
19	2,93	0,75	0,05	0,70	0,0007	0,004	0,175
20	2,91	0,80	0,05	0,75	0,00075	0,004	0,188
21	2,88	0,90	0,05	0,85	0,00085	0,004	0,213
22	2,86	1,00	0,05	0,95	0,00095	0,004	0,238
23	2,83	1,10	0,05	1,05	0,00105	0,004	0,263
24	2,8	1,20	0,05	1,15	0,00115	0,004	0,288
25	2,76	1,30	0,05	1,25	0,00125	0,004	0,313
26	2,71	1,40	0,1	1,30	0,0013	0,004	0,325
27	2,67	1,50	0,1	1,40	0,0014	0,004	0,350
28	2,63	1,60	0,1	1,50	0,0015	0,004	0,375
29	2,58	1,70	0	1,70	0,0017	0,004	0,425
30	2,54	1,80	0	1,80	0,0018	0,004	0,450
31	2,5	1,90	0	1,90	0,0019	0,004	0,475
32	2,46	2,00	0	2,00	0,002	0,004	0,500
33	2,43	2,10	0	2,10	0,0021	0,004	0,525
34	2,39	2,20	0	2,20	0,0022	0,004	0,550
35	2,36	2,30	0	2,30	0,0023	0,004	0,575
36	2,33	2,40	0	2,40	0,0024	0,004	0,600
37	2,29	2,50	0	2,50	0,0025	0,004	0,625
38	2,26	2,60	0	2,60	0,0026	0,004	0,650
39	2,23	2,70	0	2,70	0,0027	0,004	0,675
40	2,19	2,80	0	2,80	0,0028	0,004	0,700
41	2,16	2,90	0	2,90	0,0029	0,004	0,725
42	2,13	3,00	0	3,00	0,003	0,004	0,750
43	2,1	3,10	0	3,10	0,0031	0,004	0,775
44	2,06	3,20	0	3,20	0,0032	0,004	0,800
45	2,03	3,30	0	3,30	0,0033	0,004	0,825
46	2	3,40	0	3,40	0,0034	0,004	0,850
47	1,97	3,50	0	3,50	0,0035	0,004	0,875
48	1,93	3,60	0	3,60	0,0036	0,004	0,900
49	1,9	3,70	0	3,70	0,0037	0,004	0,925
50	1,88	3,80	0	3,80	0,0038	0,004	0,950
51	1,84	3,90	0	3,90	0,0039	0,004	0,975
52	1,8	4,00	0	4,00	0,004	0,004	1,000

∗ Miareczkowanie alaniny zasadą sodowoą NaOH Tabela nr 3

L.p	pH	Vtitranta suma	Vtitranta H20 [ml]	Vtitranta końcowe [ml]	ntitrant	naa	ntitr/naa
0	6,28	0	0	0	0	0,004	0
1	7,16	0,01	0,05	-0,04	-0,00004	0,004	-0,01
2	7,54	0,02	0,05	-0,03	-0,00003	0,004	-0,0075
3	7,91	0,03	0,05	-0,02	-0,00002	0,004	-0,005
4	8,03	0,04	0,05	-0,01	-0,00001	0,004	-0,0025
5	8,17	0,05	0,05	0	0	0,004	0
6	8,63	0,1	0,05	0,05	0,00005	0,004	0,0125
7	8,71	0,15	0,05	0,1	0,0001	0,004	0,025
8	8,78	0,2	0,05	0,15	0,00015	0,004	0,0375
9	8,84	0,25	0,05	0,2	0,0002	0,004	0,05
10	8,89	0,3	0,05	0,25	0,00025	0,004	0,0625
11	8,97	0,4	0,05	0,35	0,00035	0,004	0,0875
12	9,04	0,5	0,1	0,4	0,0004	0,004	0,1
13	9,11	0,6	0,1	0,5	0,0005	0,004	0,125
14	9,16	0,7	0,1	0,6	0,0006	0,004	0,15
15	9,22	0,8	0,1	0,7	0,0007	0,004	0,175
16	9,27	0,9	0,1	0,8	0,0008	0,004	0,2
17	9,34	1	0,1	0,9	0,0009	0,004	0,225
18	9,38	1,1	0,2	0,9	0,0009	0,004	0,225
19	9,44	1,2	0,2	1	0,001	0,004	0,25
20	9,48	1,3	0,2	1,1	0,0011	0,004	0,275
21	9,5	1,4	0,2	1,2	0,0012	0,004	0,3
22	9,58	1,6	0,2	1,4	0,0014	0,004	0,35
23	9,66	1,8	0,2	1,6	0,0016	0,004	0,4
24	9,75	2	0,2	1,8	0,0018	0,004	0,45
25	9,81	2,2	0,2	2	0,002	0,004	0,5
26	9,88	2,4	0,2	2,2	0,0022	0,004	0,55
27	9,96	2,6	0,2	2,4	0,0024	0,004	0,6
28	10,06	2,8	0	2,8	0,0028	0,004	0,7
29	10,15	3	0	3	0,003	0,004	0,75
30	10,26	3,2	0	3,2	0,0032	0,004	0,8
31	10,42	3,4	0	3,4	0,0034	0,004	0,85
32	10,53	3,6	0	3,6	0,0036	0,004	0,9
33	10,56	3,65	0	3,65	0,00365	0,004	0,9125
34	10,6	3,7	0	3,7	0,0037	0,004	0,925
35	10,65	3,75	0	3,75	0,00375	0,004	0,9375
36	10,68	3,8	0	3,8	0,0038	0,004	0,95
37	10,7	3,85	0	3,85	0,00385	0,004	0,9625
38	10,78	3,9	0	3,9	0,0039	0,004	0,975
39	10,86	3,95	0	3,95	0,00395	0,004	0,9875
40	10,94	4	0	4	0,004	0,004	1
41	11,01	4,05	0	4,05	0,00405	0,004	1,0125
42	11,1	4,1	0	4,1	0,0041	0,004	1,025
43	11,23	4,15	0	4,15	0,00415	0,004	1,0375
44	11,36	4,2	0	4,2	0,0042	0,004	1,05
45	11,44	4,25	0	4,25	0,00425	0,004	1,0625
46	11,58	4,3	0	4,3	0,0043	0,004	1,075
47	11,65	4,35	0	4,35	0,00435	0,004	1,0875
48	11,72	4,4	0	4,4	0,0044	0,004	1,1
49	11,76	4,45	0	4,45	0,00445	0,004	1,1125
50	11,84	4,55	0	4,55	0,00455	0,004	1,1375
51	11,9	4,65	0	4,65	0,00465	0,004	1,1625
52	11,95	4,75	0	4,75	0,00475	0,004	1,1875
53	12	4,85	0	4,85	0,00485	0,004	1,2125
54	12,06	4,95	0	4,95	0,00495	0,004	1,2375
55	12,11	5,05	0	5,05	0,00505	0,004	1,2625
56	12,16	5,25	0	5,25	0,00525	0,004	1,3125
57	12,21	5,45	0	5,45	0,00545	0,004	1,3625
58	12,25	5,65	0	5,65	0,00565	0,004	1,4125
59	12,3	5,85	0	5,85	0,00585	0,004	1,4625
60	12,33	6,05	0	6,05	0,00605	0,004	1,5125

Grupa karboksylowa pK₁=2,14

Grupa aminowa pK₂=9,19

Tabela nr 4

Aminokwas	Wartość obliczona	Wartość literaturowa	Przedział buforowania
Alanina	pI	5,665	6,11
	pK1	2,14	2,34
	pK2	9,19	9,69

∗ Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny Tabela nr 5

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
pH	2,80	2,97	3,15	3,31	3,49	3,63	3,71	3,83	3,89
Zmętnienie	-	-	+	+	++	++	++	+	+
Osad	-	-	+	+	+++	++	+	-	-
NIE WYTRĄCIŁ SIĘ OSAD POWSTAŁO TYLKO ZMĘTNIENIE

Gdzie:

- brak

+ słabe/mało

++ silne/ dużo

+++ bardzo silne/ bardzo dużo

pI kazeiny = 3,2

1. Przykładowe obliczenia:

V_titranta^aa = V_titranta − V_titranta^H₂O

Dla alaniny:

V_HCl^aa = V_HCl − V_HCl^H₂O = 0, 05ml − 0.05ml = 0 ml

$\text{pI} = \frac{\text{pK}_{1} + \text{pK}_{2}}{2} = \frac{2,14 + 9,19}{2} = 5,665$

1. Wnioski

Cel ćwiczenia został osiągnięty. Wykreśliliśmy krzywe miareczkowania alaniny. Określiliśmy punkt izoelektryczny, wartości pK grup funkcyjnych i przedziały buforowania. Alanina: pK dla grupy aminowej wynosi 9,19, a dla grupy karboksylowej 2,14. Wartości są zbieżne z danymi literaturowymi, które podają odpowiednio wartości pK: 9,69 i 2,34. Następnie obliczyliśmy pI – 5,665 (wg źródła 6,11. Wyniki zatem lekko odbiegają od siebie, a niewielkie różnice mogą wynikać z zanieczyszczonych probówek, niedokładnego wypłukania lub osuszenia pehametru, z którym wystąpiły problemy z kalibracją, dlatego też przeprowadziliśmy miareczkowanie tylko jednego aminokwasu.

Kolejnym celem doświadczenia było wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny. Punkt izoelektryczny oznaczamy poprzez ocenę zmętnienia roztworu kazeiny w buforze octanowym o różnym pH. Roztwór kazeiny, tak jak roztwory innych białek jest trwały tylko wtedy, kiedy cząsteczki koloidu mają ładunek elektryczny różny od zera. W pobliżu punktu izoelektrycznego jego zmętnienie silnie wzrasta na skutek występowania koagulacji spowodowanej utratą ładunku cząsteczek koloidalnych oraz obecnością soli. W punkcie izoelektrycznym koagulacja osiąga swoje maksimum. Punkt izoelektrycny kazeiny dla doświadczenia wynosi 3,49. Według danych literaturowych jest to wartość około 4,6 [1]. Ta duża rozbieżność wskazuje, że badany roztwór mógł być zanieczyszczony. Ponadto metoda „na oko” jest niedokładna i subiektywna, zatem wyniki są tylko przybliżone.

Reasumując – zarówno roztwory białek jak i aminokwasów wykazują właściwości amfoteryczne, co można wykorzystywać do badań nad nimi. Ponadto mają właściwości buforujące. Dzięki dużej pojemności buforowej białek osocza należy zawdzięczać np. stałość pH krwi, mimo że przebiegają w niej stale liczne procesy metaboliczne.