Cel ćwiczenia: Wyizolowanie komórek szpiku kostnego szynszyli małej (Chinchilla lanigera) – sporządzanie preparatów utrwalonych.
Przygotowanie materiału:
- wypłukano szpik kostny z kości udowej szynszyli małej przy użyciu roztworu PBS z dodatkiem 0,1% kolchicyny (C22H25O6N)
PBS – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej o izotonicznym charakterze, nie wykazuje toksyczności dla żywych komórek. Zawiera w swoim składzie chlorek sodu i fosforan sodu, czasem także chlorek potasu i fosforan potasu; nie zawiera wapnia i magnezu. Pozwala utrzymać stałe pH.
Kolchicyna – toksyczny alkaloid, który zatrzymuje podziały mitotyczne na etapie metafazy poprzez uniemożliwienie wytwarzania mikrotubul wrzeciona kariokinetycznego.
- materiał poddano wirowaniu (8 minut przy 1500 rpm), po czym odciągnięto supernatant znad powstałego osadu
Hipotonizacja materiału:
- do osadu dodano 0,075 M KCl z dodatkiem 0,1% kolchicyny o temp. 37%, następnie poddano 25 minutowej inkubacji przez 25 minut (zamiast KCl można wykorzystać cytrynian sodu)
Roztwór hipotoniczny – roztwór o mniejszym stężeniu związków osmotycznie czynnych niż roztwór wewnątrz komórki. Komórki tkanki żywej umieszczone w wodnym roztworze hipotonicznym na drodze osmozy wchłaniają wodę i nabierają objętości.
Utrwalenie materiału:
- po zakończeniu inkubacji umieszczono probówkę w lodzie i dodano kroplę utrwalacza Carnoy’a; po minucie dodano dwie krople utrwalacza, a po kolejnej minucie 3 krople utrwalacza.
Niską temperaturę stosujemy w celu przerwania hipotonizacji. Natomiast dodawanie utrwalacza po kropli zabezpiecza przed gwałtownym działaniem lodowatego kwasu octowego, który dodany jednorazowo mógłby zniszczyć strukturę chromatyny.
-po minutowej inkubacji materiał poddano wirowaniu i trzykrotnie płukano w roztworze Carnoy’a:
Odciągnięto supernatant, aby w probówce został 1 ml roztworu
Probówkę uzupełniono roztworem Carnoy’a do 5 ml, jednocześnie mieszając zawartość probówki przy użyciu wortexu
Wirowano przez 5min. przy obrotach 1500rpm
-odciągnięto supernatant zostawiając 1ml zawiesiny, którą następnie przepipetowano.
Utrwalacz Carnoy’a- mieszanina metanolu i lodowatego kwasu octowego, zmieszanych w stosunku 3:1. Utrwala on struktury wewnątrz jądra, a także służy do odbiałczania (głównie z białek cytoplazmatycznych).
Wykonanie preparatu:
- na odtłuszczone szkiełko podstawowe w środowisku pary wodnej, nachylone pod kątem naniesiono z wysokości około pół metra, 3-5 kropli zawiesiny.
Krople zawiesiny spuszczamy na szkiełko z wysokości, aby roztwór rozprowadził się równomiernie na całej powierzchni szkiełka.
Wnioski: W wykonanym preparacie mikroskopowym widoczna jest duża liczba jąder interfazowych. Świadczy to o fakcie, że podczas etapu płukania probówki z zawiesiną worteksowany zbyt słabo i zbyt krótko. Ze względu na dużą ilość tych jąder trudne jest określenie indeksu mitotycznego. W niektórych płytkach metafazowych stopień rozproszenia chromosomów jest dobry, podczas gdy w niektórych struktury te są słabo widoczne. Liczba komórek dzielących się (w stadium metafazy) wynosi 63.