Cel ćwiczenia: barwienie preparatów chromosomowych przy użyciu różnych metod

Technika klasycznego barwienia barwnikiem Giemsy

Metoda powoduje jednolite wybarwienie ramion chromosomowych na fioletowo, niewybarwione zostają jedynie obszary przewężenia wtórnego i pierwotnego. Klasyczne barwienie 10% barwnikiem Giemsy umożliwia określenie liczby i ogólnej morfologii chromosomów kompleksu.

Wykonanie:

Wcześniej przygotowany preparat chromosomowy ze szpiku kostnego szynszyla (Chinchilla lanigera) barwiono 10% barwnikiem Giemsy w buforze Sorensena [mieszanina Na₂HPO₄ oraz KH₂PO₄ w stosunku (1:1) o pH=6,8] przez 20 minut. Preparaty wypłukano w wodzie destylowanej i wysuszono w temperaturze pokojowej

Wynik barwienia:

Obserwacje i wnioski:

W wyniku barwienia preparatu pod mikroskopem można było zaobserwować płytki metafazowe. Chromosomy są jednolicie wybarwione, ale rozmieszczenie w płytce nie umożliwia jednoznacznego określenia ich liczby, ponieważ nakładają się na siebie. Taki układ utrudnia także identyfikację płci osobnika. Jednak w domyśle może to być samica (2n = 64,XX), ponieważ szynszyla ma niezwykle duży chromosom X i 6-krotnie mniejszy od niego chromosom Y. Zastosowanie barwienia różnicowego umożliwiłoby pewną identyfikację chromosomów płci. Barwienie barwnikiem Giemsy pozwala zlokalizować przewężenia pierwotne większości chromosomów.

Metoda suszenia (Ag-NOR staining)

Jest najczęściej stosowaną metodą barwienia organizatorów jąderkotwórczych. Zastosowany azotan srebra wybarwia białka związane z aktywnym transkrypcyjnie DNA.

Wykonanie:

Preparaty zamknięto w 4% roztworze AgNO₃ [zmieszany z roztworem żelatyny oraz kwasu mrówkowego w stosunku 2:1] , a następnie inkubowano je przez 20 minut w komorze wilgoci (37°C).

Aby zaszła reakcja wytrącenia metalicznego srebra, inkubacje prowadzono bez dostępu światła. Następnie preparaty przepłukano wodą destylowaną i wysuszono w temperaturze pokojowej. Tak przygotowany preparat barwiono 4% roztworem barwnika Giemsy w buforze Sorensena [mieszanina Na₂HPO₄ i KH₂PO₄ w stosunku 1:1 o pH=6,8] przez 8 sekund.

Wynik barwienia:

Obserwacje i wnioski:

W obszarach jąderkotwórczych następuje wytrącenie metalicznego srebra, co w obrazie mikroskopowym jest widoczne w postaci ‘ciemnych plam’. Szynszyla posiada 2 organizatory jąderkotwórcze, jednak nie można określić ich położenia w preparacie z powodu niedokładności przeprowadzonego barwienia (nieprecyzyjne przepłukiwanie wodą destylowaną).

Konwencjonalna analiza przebiegu mejozy w spermatocytach

Metoda ta umożliwiła nam oznaczenie stadium profazy w komórkach.

Wykonanie:

Pobrano materiał w postaci wycinka jądra myszy domowej (Mus musculus) i wykonano jego macerację [umożliwia ona uwolnienie spermatocytów z kanalików plemnikotwórczych]. Następnie homogenizat przeniesiono do 50 ml roztworu hipotonicznego [1% Na₃C₆H₅O₇ x 2H₂O] i poddano wytrząsaniu [w celu wypłukania pojedynczych komórek z kanalików nasieniotwórczych]. W odstępach 15 minutowych odbierano materiał z probówek na wytrząsarce. Czynność powtórzono 4 razy. Zawiesinę komórek odwirowano i usunięto supernatant. Dodano 5 ml utrwalacza Carnoy`a [mieszanina metanolu i lodowatego kwasu octowego w stosunku 3:1]. Czynność powtarzano 5-6 razy.

Wyniki barwienia:

Obserwacje i wnioski:

Zaobserwowano jądra komórkowe w stadium profazy. Na podstawie stopnia kondensacji chromatyny można przypuszczać, że jest to leptoten. Chromatyna nie jest jeszcze silnie skondensowana jednakże występują ciemniejsze punkty, które świadczą prawdopodobnie o wyodrębnionych chromosomach. Materiał genetyczny jest rozłożony nierównomiernie w obrębie całej objętości jądra komórkowego.

Zdjęcie nr 2

Obserwacje i wnioski:

Obraz mikroskopowy przedstawia najprawdopodobniej komórkę w fazie czwartego etapu profazy I mejozy – diplotenu. Podczas tego stadium na skutek spiralizacji następuje maksymalne skrócenie chromosomów; chromosomy homologiczne odpychają się w wyniku zanikania kompleksu synaptonemalnego (struktura zbudowana z białek, łącząca dwa homologiczne chromosomy tworzące biwalent) i rozsuwają, pozostawiając chiazmy, które reprezentują miejsca, gdzie odbył się proces crossing-over.