Ćwiczenie 3: Elektroforeza białek w denaturującym żelu poliakrylamidowym

Część teoretyczna do kolokwium:

metody elektroforezy białek (elektroforeza natywna, w żelu denaturującym, ogniskowanie izoelektryczne, elektroforeza dwukierunkowa), zadania rachunkowe.

Materiały i odczynniki:

Preparaty z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych izolowane na ćwiczeniu 1

Preparaty z izolacji białek wiążących DNA (wszystkie frakcje) z ćwiczenia 2

Żel rozdzielający 12%

H2O	2.12 ml
1M Tris:HCl pH 8.8	2.63 ml
40% akrylamid	2.1 ml
20% SDS	35 µl
10% APS	70 µl
razem:	7 ml

Żel zagęszczający 6%, 2 ml:

H2O	1.47 ml
1M Tris:HCl pH 6.8	250 μl
40% akrylamid	254 μl
20% SDS	10 μl
10% APS	20 μl
razem:	2 ml
dodać TEMED	2 μl

Bufor obciążający 6x stężony:
60% glicerol; Tris:HCl pH 6.8; EDTA; 12% SDS; 2-merkaptoetanol; 0.05% błękit bromofenolowy

Bufor do elektroforezy:
glicyna; 0.1% SDS; Tris:HCl pH 8.3

Markery białkowe „prestained”(Fermentas)

Barwnik do żelu:

Coomassie Blue R; 45 ml H₂O; 45 ml metanolu; 10 ml kwasu octowego 99.9%

Odbarwiacz do żelu:

750 ml H₂O; 150 ml metanolu; 100 ml kwasu octowego 99.9%

WYKONANIE:

Przygotowanie żelu i prób do elektroforezy

Uwaga! Niespolimeryzowany akrylamid jest trujący – należy bezwzględnie używać rękawiczek (obu!) i nie rozlewać roztworów.

1. Wylewanie żelu

   1. Złożyć szyby – jedna zawierająca odstępniki, druga gładka – spiąć klipsami
      i zamocować na podstawce. Włożyć grzebień
      i zaznaczyć pisakiem granicę żelu rozdzielającego
      na od dolnej granicy grzebienia.

   2. Przygotować wg. instrukcji 7 ml 12% żelu\, poliakrylamidowego bez dodatku TEMED. Przenieść do osobnej probówki 1 ml roztworu, dodać 2 μl TEMED, wylać przy pomocy pipety automatycznej (1000 μl) pomiędzy szyby. Odczekać aż spolimeryzuje.

   3. Do pozostałej mieszaniny dodać 4 μl TEMED, od razu wylać pomiędzy szyby
      do zaznaczonego poziomu. Na powierzchnię niespolimeryzowanego żelu nanieść bardzo ostrożnie 1 ml H₂O. Pozostawić do spolimeryzowania.

   4. Przygotować 2 ml żelu zagęszczającego wg. instrukcji, bez dodatku TEMED. Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, wylać wodę i wysuszyć szyby bibułą. Do przygotowanego żelu dodać 2 μl TEMED, od razu wylać pomiędzy szyby do utworzenia menisku wypukłego, włożyć delikatnie grzebień tak, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza. Pozostawić do spolimeryzowania.

prawidłowo wylany żel

1. Przygotowanie preparatów (w czasie oczekiwania na spolimeryzowanie żelu)

WSZYSTKIE PROBÓWKI MUSZĄ BYĆ PODPISANE!

Podpisać probówki numerami 1-7. Z preparatów EC (ekstrakt cytoplazmatyczny) i EJ (ekstrakt jądrowy) pobrać po 20 μg białka (obliczyć na podstawie oznaczonych stężeń) do osobnych ependorfów (nr 1 i 2). Jeżeli brak preparatów własnych, należy poprosić o odpowiednią ilość ekstraktu u prowadzącego ćwiczenia. Preparat EC uzupełnić NaCl tak, aby końcowe stężenie NaCl wynosiło , w razie potrzeby dodać NaCl (objętość końcowa = 15 µl). Preparat EJ uzupełnić wodą i NaCl do takich samych warunków. Do osadu białkowego z ćw. 2 dodać
15 µl H₂O (nr 3).

Pobrać 20 μg (lub 15 µl) preparatu EC/EJ-NZ (do probówki nr 4) i dopełnić NaCl do 15 μl. Ze wszystkich frakcji pobrać po 20 μl preparatów kolejno do probówek: 5 (F1), 6 (F2) i 7 (F3).

Do preparatów 1, 2 i 4 dodać po 3 μl LB 6x, do preparatów 5-7 dodać po 4 μl buforu LB 6x.

Wszystkie próby (1-7) gotować 3 min. w termobloku (), zwirować krótko (przycisk „short”)
na maksymalnych obrotach, przenieść do nowych probówek, podpisanych tak samo: 1-7.

3. Elektroforeza preparatów białkowych

-Przygotowanie buforu do elektroforezy:
Do cylindra o pojemności 1000 ml wlać 200 ml buforu do elektroforezy stężonego 5x
i dopełnić do 1000 ml.

Złożyć żele (2 lub 4 żele do jednego aparatu) wg. instrukcji:

a. Wszystkie kieszonki podkreślić pisakiem i podpisać kolejno: X, X, X (puste kieszonki), M, 1, 2...7 X, X, X, X.. Szyby ułożyć dłuższą częścią na zewnątrz:

b. Rozpiąć stelaż i wstawić całość do stelaża:

c. Po wstawieniu szyb zamknąć stelaż przytrzymując szyby od góry i całość włożyć do naczynia:

Wlać bufor do elektroforezy do wewnętrznej części pomiędzy szyby, aż do samej góry
i do zewnętrznej części - do poziomu zaznaczonych ścieżek (tak, aby nie zamazać napisów).

-Nanoszenie preparatów:

Do ścieżki oznaczonej literą M nanieść marker masy (5 μl). Do następnych ścieżek nanosić kolejno preparaty: 1-7 (w całości).

Elektroforezę prowadzić pod napięciem 100 V przez 15 min., następnie zwiększyć napięcie
do 200 V (maksymalne natężenie prądu nie może przekraczać 300 mA). Czas trwania elektroforezy – do przejścia barwnika do końca żelu (40-50 min.).

4. Wybarwianie żelu

1. Po skończonej elektroforezie, aparat rozłożyć, wyjąć szyby i rozdzielić je, posługując się łopatką (uwaga, nie uszkodzić żelu). Zaznaczyć żel.

2. Łopatką odciąć żel zagęszczający i korek, żel ostrożnie przenieść do przygotowanego pudełeczka i zalać barwnikiem (barwnik zawiera metanol, dlatego należy pracować
   pod wyciągiem).

3. Żel postawić na kołysce i barwić 30 min.

4. Ostrożnie zlać barwnik do butelki, a żel zalać odbarwiaczem (również pod wyciągiem).

5. Pozostawić na kołysce do odbarwienia tła.

6. Przez dwa kolejne dni po jednej osobie z grupy przychodzi rano (koniecznie trzeba się umówić) do pracowni. Zużyty odbarwiacz należy zlać do butelki z węglem aktywnym (regeneracja), na żele należy nalać nową porcję odbarwiacza.

5. Sprawozdanie

1. Należy skrótowo opisać wylewanie żelu i przygotowanie buforu do elektroforezy.

2. Dokładnie (wraz ze wszystkimi obliczeniami) opisać przygotowanie prób do elektroforezy
   z zaznaczeniem, o jaki preparat chodzi (nie tylko skrót).

3. Opisać, który preparat (łącznie z nr probówki) znajduje się w której kieszonce.

4. Zdjęcie żelu (dostarczone po odbarwieniu tła) musi być podpisane:

   1. Marker ma być opisany obok żelu, masami cząsteczkowymi białek (zgodnie
      z instrukcją).

   2. Każda kieszonka powinna być podpisana numerem, a numery opisane w legendzie pod spodem rysunku.

5. We wnioskach należy opisać, w których preparatach widoczne są białka w postaci prążków
   (w preparatach z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych powinno ich być dużo,
   o różnych masach), w których nie. Spróbować zanalizować dlaczego. (należy sięgnąć do wyników oznaczeń białek z poprzedniego ćwiczenia. Jeśli we frakcjach
   z chromatografii są widoczne białka, opisać ich przybliżone masy (wg markera). Dla przykładu pokazuję zdjęcie z elektroforezy samych histonów (z Internetu www.biochemj.org/bj/322/0281/bj3220281.htm)

MOJE UZUPEŁNIENIE

Elektroforeza natywna:

• w warunkach niedenaturujących białka (ani bufor do elektroforezy ani bufor do rozpuszczania białek nie zawiera np. mocznika, SDS, chlorowodorku guanidyny)

• dla kompleksów białkowych ulegających rozpadowi w warunkach denaturujących

• można prowadzić w układzie ciągłego lub nieciągłego żelu

• najpopularniejsze techniki: Blue Native PAGE, Clear Native PAGE

• barwnik Coomassie Blue nadaje białkom wypadkowy ładunek ujemny i uwidocznia ich migrację w żelu. Może działać jako detergent i powodować dysocjację kompleksów białkowych oraz może hamować aktywność enzymatyczną

• brak detergentów uwidocznia tendencję białek do tworzenia agregatów

• wada metody: słaba rozdzielczość

• zaleta metody: możliwość odzyskania cząsteczek białkowych w stanie pełnej aktywności biologicznej

• separacja dzięki różnicy ładunków własnych białek

• metoda wyznaczania masy białka dzięki porównaniu ruchliwości białka o nieznanej masie z ruchliwością białek o znanej masie i podobnym kształcie

Elektroforeza w żelu denaturującym (SDS-PAGE):

• pozwala na łatwe i dokładne oznaczenie mas cząsteczkowych rozdzielonych białek

• SDS – silny detergent jonowy (ang. sodium dodecyl sulfate) o hydrofobowym łańcuchu węglowym i polarnej siarczanowej głowie. SDS denaturuje białko i nadaje mu ładunek ujemny niezależny od wewnętrznego ładunku białka i masy. Ruchliwość kompleksu białko-SDS jest zależna do jego masy. Substancja powierzchniowo czynna.

• SDS – niszczy oddziaływania niekowalencyjne decydujące o przestrzennej strukturze molekuły białkowej

• czynnik redukujący, na przykład DTT (ditiotreitol), odpowiada za niszczenie mostków dwusiarczkowych w strukturach białek

• zdenaturowane białko wędruje w polu elektrycznym jako rozwinięty monomer (brak aktywności biologicznej i struktury czwartorzędowej).

•  separacja białek odbywa się zgodnie z masami cząsteczkowymi

• białka poruszają się w żelu w kierunku elektrody dodatniej z szybkością zależną jedynie od ich wielkości

•  barwienia kompleksów białko-SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka

• zamiast SDS można użyć mocznika, który wiąże się z białkiem w sposób odwracalny. Wtedy nie nadaje się białku ładunku, w związku z czym porusza się ono zgodnie z własnym wewnętrznym ładunkiem, pomimo stanu zdenaturowanego.

Ogniskowanie izoelektryczne (IEF):

• amfoteryczne substancje (białka, peptydy) migrują w polu elektrycznym w kierunku elektrod o znaku przeciwnym ich ładunkowi. W elektrolicie o wartości pH równej wartości pI wypadkowy ładunek makrocząsteczki równa się zeru i obojętna elektrycznie makrocząsteczka zatrzymuje się nie doznając działania sił pola elektrycznego. Uzyskuje się w ten sposób separację molekuł białkowych zgodnie z ich wartościami pI. 

• pH środowiska wpływa na ładunek netto białka (niskie pH — dodatni, wysokie pH — ujemny).

• punkt izoelektryczny pI — pH przy którym ładunek netto cząsteczki jest równy 0 (zależnie od składu aminokwasowego i modyfikacji potranslacyjnych). Jest to biofizyczny parametr charakteryzujący białko, który wyznaczamy poprzez ogniskowanie izoelektryczne.

Elektroforeza dwukierunkowa (2DE):

• metoda stosowana najczęściej do rozdziału i analizy mieszanin białkowych, takich jak kompletny zestaw białek danej populacji

• pozwala na rozdział białek w dwóch kierunkach

• rozdział pod względem punktu izoelektrycznego (1D), a następnie pod względem masy białek (2D)

• do rozdziału od ponad stu do kilku tysięcy różnych białek

Elektroforeza ciągła:

• Systemy elektroforezy ciągłej używają buforów o identycznym pH do sporządzania żelu, przygotowywania próbki i przeprowadzania elektroforezy. Ponieważ białka z próbki nie ulegają zatężeniu, konieczne jest nanoszenie na żel próbek o niewielkiej objętości. Jakość rozdziału bardzo zależy od „wysokości” naniesionej próbki. 

Elektroforeza nieciągła:

W systemie elektroforezy nieciągłej stosuje się dwa rodzaje żelu: zatężający i rozdzielający. Podczas elektroforezy próbka najpierw przechodzi przez żel zatężający a następnie przez żel rozdzielający. Przejście przez żel zatężający sprawia, że białka ulegają ściśnięciu do bardzo wąskiego paska (~0,1mm), dzięki czemu wnikają one w żel rozdzielający praktycznie w tym samym czasie, co pozwala na uzyskanie ostrych i wyraźnych prążków. 

APS – nadsiarczan amonu (NH₄)₂S₂O₈

• sól amonowa kwasu nadsiarkowego

• silne właściwości utleniające

• inicjator wolnych rodników

• wraz z TEMEDem inicjuje reakcję polimeryzacji akrylamidu

SDS – dodecylosiarczan sodu, sól sodowa kwasu dodecylosiarkowego C₁₂H₂₅SO₄Na

• silny detergent jonowy (ang. sodium dodecyl sulfate) o hydrofobowym łańcuchu węglowym i polarnej siarczanowej głowie

• denaturuje białko i nadaje mu ładunek ujemny niezależny od wewnętrznego ładunku białka i masy

• ruchliwość kompleksu białko-SDS jest zależna do jego masy

• substancja powierzchniowo czynna.

Tris – 2-amino-2hydroksymetylo-propano-1,3-diol (HOCH₂)₃CNH₂

• stabilizacja pH (7-9)

• hamuje szereg enzymów

• zwiększanie przepuszczalności błon komórkowych

Tris-HCl

• utrzymywanie stałego, lekko zasadowego pH roztworu

• zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne między DNA a zasadowymi białkami

TEMED – N, N, N’, N’ – tetrametyloetylenodiamina C₆H₁₆N₂

• katalizator polimeryzacji akrylamidu

• powoduje rozbicie cząsteczek nadsiarczanu amonu, który daje rodniki niezbędne do polimeryzacji

• skuteczny związek chelatujący

EDTA – kwas (etylenodinitrylo)tetraoctowy, kwas edetynowy/wersetowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy C₁₀H₁₆N₂O₈

• wiąże jony metali Cd, Mg, Mn, które mogłyby tworzyć sole z anionowymi grupami fosforanowymi DNA

• hamuje działanie deoksyrybonukleaz

Akrylamid – prop-2-enoamid, amid kwasu 2-propenowego (akrylowego) C₃H₅NO

• stosowany jako monomer przy produkcji poliakrylamidu

• neurotoksyna

2-merkaptoetanol C₂H₆OS

• w wysokich stężeniach redukuje mostki dwusiarczkowe co prowadzi do degradacji 3- i 4-rzędowej struktury białka

• środek redukujący, tak jak DTT

• nie migruje wraz z białkami podczas elektroforezy (możliwy negatywny wpływ na rozdział)

Błękit bromofenolowy C₁₉H₁₀O₅Br₄S

• barwa niebieska/fioletowa 4 > pH < 3 – barwa żółta

• marker do kontroli procesu elektroforezy

Glicyna – kwas 2-aminoetanowy C₂H₅NO₂

• aminokwas biogenny

• przy pH 8,3 „ucieka” od ujemnie naładowanej elektrody w kierunku żelu zagęszczającego i prób

• przy pH 6,8 traci większość ładunków ujemnych co zmniejsza jej ruchliwość

Bufor obciążający:

• ułatwia ładowanie próbek do studzienek

• wskazuje na postęp migracji fragmentów

• zawiera zwykle glicerol i barwniki