Ćwiczenie 2

Izolacja białek wiążących DNA metodą chromatografii powinowactwa.

Kolokwium (na podstawie wykładu z I i II roku):

Metody rozdziału białek (wytrącanie i chromatografia - nie tylko powinowactwa!)

1. Materiały:

Ekstrakty białkowe wyizolowane na poprzednich ćwiczeniach

Bufory do wiązania i elucji białek:

Bufor do rozdziału bez NaCl (20 mM tris HCl pH 7.5; 5% glicerol; 5 mM MgCl₂; 1 mM DTT)

Bufor do rozdziału 0.2M NaCl (20 mM tris HCl pH 7.5; 5% glicerol; 5 mM MgCl₂; 1 mM DTT; 0.2M NaCl)

Bufor do rozdziału 0.4M NaCl (20 mM tris HCl pH 7.5; 5% glicerol; 5 mM MgCl₂; 1 mM DTT; 0.4M NaCl)

Bufor do rozdziału 0.8M NaCl (20 mM tris HCl pH 7.5; 5% glicerol; 5 mM MgCl₂; 1 mM DTT; 0.8M NaCl)

4xSB (bufor do nanoszenia próbek na SDS-PAG)

DNA-celuloza zawieszona w buforze do rozdziału 0.2M NaCl

Wirówka umieszczona w szafie chłodniczej/z chłodzeniem

Kołyska laboratoryjna umieszczona w szafie chłodniczej

Vortex

B. Wykonanie

1. Otrzymane na poprzednich ćwiczeniach ekstrakty EC (sekcje parzyste) lub EJ (sekcje nieparzyste) rozmrozić na lodzie. Delikatnie zamieszać.

2. Próbki odwirować (4⁰C; 5 min; maksymalne obroty)

3. Otrzymany po wirowaniu supernatant przenieść do nowych probówek podpisanych EC1 (sekcje parzyste) lub EJ1 (sekcje nieparzyste). Osad zawiesić w 10μl 4xSB
   i zamrozić.

4. Zmierzyć objętość roztworu w probówce EC1/EJ1 i stężenie białka metoda Bradforda (jak w poprzednim ćwiczeniu).

5. Z probówki EC1/EJ1 pobrać 800μg białka do osobnej probówki (EC2/EJ2). Jeżeli w preparacie nie ma tyle białka, proszę zgłosić się do prowadzącego.

6. Do probówki EC2/EJ2 dodać taką ilość buforu do rozdziału bez NaCl lub buforu do rozdziału 0.4M NaCl, by otrzymać roztwór o stężeniu NaCl równym 0,2M (początkowe stężenie NaCl w EC i EJ: patrz ćwiczenie I).
   Z probówki zawierającej DNA-celulozę zebrać i odrzucić nadsącz. Całą zawartość probówki EC2/EJ2 nanieść na DNA-celulozę i silnie zworteksować.

7. Probówkę dobrze zamknąć i wytrząsać 45min w 4⁰C na kołysce.

8. Próbki odwirować (4⁰C; 3 min; 1700xg). Supernatant przenieść do probówki opisanej EC-NZ/EJ-NZ (nie związane). Zmierzyć objętość supernatantu.

9. Do osadu dodać 120μl buforu do rozdziału 0.2M NaCl. Zworteksować, odwirować (4⁰C; 3min; 1700xg). Supernatant przenieść do probówki opisanej EC-F1/EJ-F1. Zmierzyć objętość supernatantu.

10. Do osadu dodać 120μl buforu do rozdziału 0.2M NaCl. Zworteksować, odwirować (4⁰C; 3min; 1700xg). Supernatant przenieść do probówki opisanej EC-F2/EJ-F2. Zmierzyć objętość supernatantu.

11. Do osadu dodać 120μl buforu do rozdziału 0.8M NaCl. Zworteksować, odwirować (4⁰C; 3min; 1700xg). Supernatant przenieść do probówki opisanej EC-F3 (EJ-F3). Zmierzyć objętość supernatantu.

12. Z próbek otrzymanych w pkt. 8 (NZ) pobrać 5μl roztworu i oznaczyć stężenie białka metodą Bradforda.

13. Z próbek otrzymanych w pkt. 9-11 (Fr1-3) pobrać po 20μl roztworu i oznaczyć stężenie białka metodą Bradforda.

14. Próbki otrzymane w pkt. 8-11 zamrozić.

C. Sprawozdanie

Sprawozdanie powinno zawierać:

1. wyjaśnienie zasady rozdziału białek w chromatografii powinowactwa

2. protokół wykonanego ćwiczenia

3. bilans izolacji białek wiążących DNA na DNA-celulozie:

	Ilość białka [μg]	% białka nałożonego na DNA-celulozę
Białko nałożone na DNA-celulozę
Białko niezwiązane z DNA-celulozą (NZ)
Białko niespecyficznie związane z DNA-celulozą (wypłukane 0.2M NaCl) (F1+F2)
Białko specyficznie związane z DNA-celulozą (wypłukane 0.8 M NaCl) (F3)

4. Czy sumaryczna ilość białka we wszystkich frakcjach jest równa ilości białka nałożonego na DNA-celulozę? Jeśli nie, to dlaczego? (proszę podać prawdopodobne przyczyny).

5. Czy ilość białek wiążących DNA izolowanych z EC i EJ powinna być podobna? Dlaczego?

---