Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia
semestr: IV

gr. dziekańska: 3

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA TŁUSZCZÓW

Data wykonania ćwiczenia: 29.04.2010

Data oddania sprawozdania: 06.05.2010 Maja Szczepaniak

Tomasz Styś Marcin Szustak

WSTĘP TEORETYCZNY

Tłuszcze – zwyczajowa nazwa grupy lipidów, estrów glicerolu i kwasów tłuszczowych, głównie triacylogliceroli. Reszty kwasowe występujące w cząsteczkach tłuszczów zawierają zwykle od 12 do 18 atomów węgla. Większość tłuszczów nie ma zapachu, jest nierozpuszczalna w wodzie i rozpuszczalnikach polarnych oraz dobrze rozpuszczalna w rozpuszczalnikach niepolarnych. Wszystkie tłuszcze są lżejsze od wody, a ich pH jest obojętne. Stan skupienia zależy od tego, jakie reszty kwasowe tworzą cząsteczkę. Tłuszcze stałe zawierają nasycone reszty kwasowe o długich łańcuchach węglowych, natomiast tłuszcze ciekłe zawierają nienasycone reszty kwasowe (reszty, w których występują wiązania podwójne) lub reszty kwasowe o krótkich łańcuchach węglowych. Kwasy nienasycone występujące w naturalnych tłuszczach są izomerami cis. Większość tłuszczów to estry mieszane, czyli takie, które w cząsteczce zawierają różne reszty kwasowe. Tłuszcze naturalne zawsze są mieszaninami różnych estrów glicerolu. Obecność monoglicerydów i dwuglicerydów świadczy na przykład o zjełczeniu tłuszczów. Proces ten polega na rozkładzie tłuszczów pozostających przez dłuższy czas pod działaniem powietrza i światła i jest rezultatem działania dwóch enzymów: lipazy i lipooksygenazy, katalizującej utlenianie uwolnionych przez lipazę kwasów tłuszczowych.

Tłuszcze mogą ulegać hydrolizie, która jest katalizowana przez enzymy zwane lipazami (należą one do klasy hydrolaz) i zachodzi w obecności wody. Produktami powstającymi w tej reakcji są np.: diacyloglocerole, monoacyloglicerole, kwasy tłuszczowe i alkohol glicerynowy. Żeby zwiększyć szybkość tego procesu tłuszcz hydrolizuje się w postaci emulsji, dzięki czemu enzym nie będzie się rozwarstwiać z tłuszczem i zwiększy się powierzchnia działania enzymu na tłuszcz. Jednym z takich emulgatorów tłuszczu jest żółć , która emulguje tłuszcze zawarte w pożywieniu.

Ogólny wzór strukturalny tłuszczu (triglicerydu), R oznacza łańcuchy alifatyczne

źródło:

• „Biochemia” Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer

• www.wikipedia.pl

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

2.1. Przygotowanie preparatu lipazy z tabletki kreonu:

Zawartość kapsułki rozcieramy na moździerzu porcelanowym, dodajemy 10ml buforu fosforanowego o pH 7. Powstałą zawiesinę dobrze mieszamy aż do rozpuszczenia roztartej zawartości tabletki.

2.2. Przygotowanie emulsji oleju:

Do zlewki o pojemności 100 ml dodajemy 60 ml 2% wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego oraz 40 ml oleju kukurydzianego. Powstałą mieszaninę homogenizujemy przez 5 minut.

2.3. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzenie reakcji:

W erlenmayerkach o pojemności 100cm³ przygotowaliśmy następujące próby z zachowaniem kolejności dodawania substratów:

1. 2 próby właściwe:

5 cm³ emulsji oleju

4 cm³ buforu

1 cm³ preparatu lipaz

Po 30 minutach (pierwsza próba) i po 60 minutach (druga próba) inkubacji w 37^oC dodaliśmy po 10 cm³ etanolu.

1. Próbę kontrolną:

5 cm³ emulsji oleju

4 cm³ buforu

10 cm³ etanolu

1 cm³ preparatu lipaz

Tak przygotowane mieszaniny miareczkowaliśmy 0,05 M NaOH w obecności fenoloftaleiny do różowego zabarwienia i otrzymaliśmy następujące wyniki:

Rodzaj oleju	Pr. kontrolna [ml]	V30’ [ml]	V60’ [ml]	ΔV30’ [ml]	ΔV60’ [ml]
Olej słonecznikowy	5,55	8,75	11,6	3,2	6,05
Olej kukurydziany	6,3	8,9	9,77	2,6	3,47
Olej ryżowy	6,1	10	14,2	3,9	8,1
Olej winogronowy	8,5	10,4	12,6	1,9	4,1

2.4. Obliczenia:
Na podstawie wyników z tabeli wyliczyliśmy aktywności badanego preparatu lipazy według wzoru:

$$A_{L} = \frac{(A - A_{0}) \bullet 50 \bullet 10}{n \bullet t}$$

Gdzie:

A_L – aktywność lipazy [U/ml lub mg]
A – objętość 0,05 molowego roztworu NaOH dla próby właściwej
A₀ – objętość 0,05 molowego roztworu NaOH dla próby kontrolnej
n – ilość preparatu lipazy [ml lub mg] w mieszaninie reakcyjnej
50 – współczynnik pozwalający przeliczyć [ml] NaOH na μM kwasu tłuszczowego
t – czas hydrolizy mieszaniny [min]
10 – ilość buforu [ml] w której rozpuściliśmy preparat lipazy

Sposób obliczeń przedstawiony na przykładzie oleju kukurydzianego:

1. Hydroliza oleju ryżowego po upływie 30 minut:

$$A_{L} = \frac{(8,9 - 6,3) \bullet 50 \bullet 10}{1 \bullet 30} = 43,33\ \frac{U}{\text{ml}}$$

1. Hydroliza oleju ryżowego po upływie 60 minut:
   
   $A_{L} = \frac{(9,77 - 6,3) \bullet 50 \bullet 10}{1 \bullet 60} = 28,92\ \frac{U}{\text{ml}}$

Za jednostkę aktywności lipazy przyjmuje się taką aktywność, która powoduje odszczepienie z substratu 1 µmola kwasu tłuszczowego w ciągu jednej minuty, w temperaturze 37°C, w pH 7.

Wyniki aktywności badanego preparatu lipazy dla różnych oleji:

Rodzaj oleju	AL30’ [U/ml]	AL60’ [U/ml]
Olej słonecznikowy	53,33	50,42
Olej kukurydziany	43,33	28,92
Olej ryżowy	65	67,5
Olej winogronowy	31,67	34,17

Wnioski:

Wraz z przebiegiem procesu wartość aktywności lipazy powinna maleć ze względu na zmniejszenie aktywności lipazy przez spadające pH w wyniku uwalniania się wolnych kwasów tłuszczowych. Po zakończeniu inkubowania dodajemy etanol w celu zatrzymania procesu.

2.5. Oznaczanie obecności innych enzymów w roztworze z tabletki kreonu:

2.5.1. Oznaczanie α-amylazy:

Sposób wykonania: Do dwóch probówek wprowadzamy po 5 ml 1% roztworu skrobi. Do pierwszej probówki wprowadzamy 3 krople preparatu enzymatycznego (roztwór tabletki kreonu – próba właściwa), a do probówki drugiej wprowadzamy 3 krople wody destylowanej (próba kontrolna). Obie probówki inkubujemy w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym dodajemy po 4 krople roztworu J₂ w KJ.

Obserwacje: W probówce z próbą właściwą następuje całkowite odbarwienie roztworu, natomiast w probówce z próbą kontrolną pozostaje granatowe zabarwienie roztworu.

Wnioski: Zabarwienie w próbie kontrolnej powstaje w wyniku wnikania w łańcuch skrobi jodu. W próbie właściwej nie ma barwy, ponieważ cała skrobia została zhydrolizowana przez amylazę do produktów takich jak: achrodekstryny, maltoza i glukoza, które nie dają zabarwienia z jodem. Reakcja ta jest zatem dobrym wskaźnikiem na obecność α-amylazy.

2.5.2. Oznaczanie proteinazy:

Sposób wykonania: Do dwóch probówek wprowadzamy po 2 ml 2% roztworu kazeiny. Do probówki pierwszej (próba właściwa) wprowadzamy 1 ml preparatu enzymatycznego a do probówki drugiej 1 ml wody destylowanej (próba kontrolna), obie probówki inkubujemy w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po tym czasie dodajemy 4 ml 5% roztworu TCA.

Obserwacje: W obu probówkach powstaje biały pylisty osad jednakże można zauważyć, że w próbie właściwej jest go znacznie mniej.

Wnioski: Wydzielonym osadem jest białko kazeina. W probówce z próbą właściwą proteinaza zhydrolizowała część białka do prostszych białek dlatego dodany roztwór TCA wytrącił mniej osadu.