Różnicowanie się mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z banków ludzkiej krwi pępowinowej w komórki wydzielające insulinę.

Najczęstszą postacią cukrzycy jest cukrzyca typu 2, polegająca na zmniejszonej wrażliwości tkanek na insulinę (insulinooporność). Stan ten wymaga produkcji nadmiernej ilości insuliny, co w dalszym przebiegu choroby przekracza zdolności wydzielnicze trzustki. Wcukrzycy typu 2, dochodzi do uszkodzenia komórek beta w wyspach trzustki i upośledzenia, a później zaprzestania wydzielania insuliny.

Cukrzyca typu 1 polega na pierwotnym, niedostatecznym wydzielaniu insuliny, przy zachowaniu normalnej wrażliwości tkanek na ten hormon. Cukrzyca ciężarnych jest wynikiem zmian hormonalnych związanych z okresem ciąży.

Mezenchymalne komórki macierzyste, również te pochodzące z krwi pępowinowej to komórki multipotentne (mogą przekształcać się w we wszystkie typy komórek w obrębie danego listka zarodkowego). W omawianym przeze mnie badaniu rozpatrywano różnicujący potencjał utrzymywanych w niskich temperaturach mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej w komórki wydzielające insulinę.

Insulina jak wiadomo jest bardzo ważnym hormonem peptydowym produkowanym przez trzustkę odgrywającym zasadniczą rolę przede wszystkim w metabolizmie węglowodanów, która sprowadza się do obniżania poziomu cukru we krwi.

Celem badania naukowców z Wietnamu było znalezienie alternatywnego sposobu leczenia cukrzycy z wykorzystaniem komórek macierzystych. Jak się okazało już znacznie wcześniej prowadzono wiele różnych badań z użyciem np. „dorosłych komórek macierzystych” pochodzących ze szpiku kostnego, jednak przypuszcza się, że zawarte w nich immunogenne endotoksyny nie pozwoliły na uzyskanie satysfakcjonujących rezultatów. Próbowano także różnicować komórki macierzyste pochodzenia embrionalnego, jednak przeszkodą okazały się tu względy etyczne. Z kolei komórki macierzyste płodowe tj. pochodzące z krwi pępowinowej wydają się odpowiednie do zastosowania klinicznego przede wszystkim ze względu na fakt, iż posiadają znacznie niższy poziom tych immunogennych endotoksyn, a ponadto ……. Z roku na rok coraz więcej krwi pępowinowej jest gromadzonej, mrożonej i magazynowanej na całym świecie w oczekiwaniu na kliniczne użycie.

Metody:

Gromadzenie i izolacja UCB

Krew pępowinowa była pobierana z żyły pępowinowej za zgodą matki. Pochodzące z niej jednojądrowe komórki zamrożono na okres 1 roku w ilości 10-100mln komórek w mililitrze (zgodnie z zasadami zmniejszając temperaturę o 1st w ciągu każdej minuty) i przechowywano w ciekłym azocie.

Po rozmrożeniu i oszacowaniu żywotności (która wynosiła więcej niż 90%) zawiesinę komórek przeniesiono do naczyń hodowlanych z 3ml medium i 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), a także 1% antybiotyków. Hodowlę utrzymywano w 37st C w wilgotnej atmosferze z 5% dopływem CO2, zmieniając medium co 2 dni. Po osiągnięciu stanu konfluencji komórki pasażowano na nowe podłoże.

Różnicowanie

Populacja komórek jednojądrowych została skłoniona do różnicowania w adipocyty (komórki tworzące tkankę tłuszczową) i osteoblasty (komórki kościotwórcze), po przeprowadzonej wcześniej serii 5 pasaży, czyli przeniesienia komórek na nowe podłoża hodowlane, w celu sprawdzenia ich zdolności proliferacyjnych.

Różnicowanie się komórek w endokrynne trzustki można podzielić na 3 umowne etapy. W kroku 1 monowarstwa komórek została potraktowana przez 24 godziny pożywką DMEN z wysoką zawartością glukozy wzbogaconej dodatkowo w 10% FBS i 10^-6 kwasu retinolowego, potem medium było zmienione na H-DMEN z 10% FBS na 2 dni. W 2 kroku medium było zmienione na L-DMEN z 10% FBS, które dodatkowo wzbogacone zostało czynnikami wzrostu (EGF) na 6 dni. W kroku 3 dorosłe komórki zdolne do wydzielania insuliny potraktowano medium z niską zawartością glukozy, lecz wzbogaconym w 10% FBS i 10mmol/L eksendyny-4 na 6 dni. Różnicowanie komórkowe było monitorowane przez obserwację trójwymiarowej formacji wyspopodobnych grup komórek, ekspresji genów związanych z rozwojem komórek endokrynnych trzustkowych i produkcji insuliny. Jako grupa kontrolna komórki były hodowane w L-DMEN zawierającym tylko 10% FBS.

Następnie wykonano cytometrię przepływową oraz RT-PCR w celu zbadania ekspresji genów. Później powiem parę słów o tych metodach.

Wyniki:

USC-MSCs były przygotowywane do transformacji w komórki wydzielające insulinę w 3 krokach. W kroku 1 nie zaobserwowano zmian morfologicznych w komórkach. Podczas późniejszej hodowli nieliczne z namnażających się komórek obumarły a te o wrzecionowatym kształcie stawały się coraz mniejsze i przekształcały się w okrągłe, owalne komórki, następowało to w około 9 dni po różnicowaniu. W kroku 3 zaczęło pojawiać się więcej tych komórek.

Komórki macierzyste krwi pępowinowej mają duży potencjał namnażania, komórki te podwajają swoją ilość w 48-72 godzin. Oprócz podobieństwa morfologicznego z komórkami wysp trzustkowych, posiadają zdolnośc przeprowadzania transkrypcji, translacji i co najważniejsze wydzielają insulinę. Komórki te zostały scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej, metody diagnostycznej umożliwiającej ocenę wielkości, intensywności zabarwienia i intensywności fluorescencji badanych komórek. Metoda ta ujawniła, że komórki pochodzące z krwi pępowinowej maiły negatywny wynik na CD14(monocytów), CD34 (hematopoetycznych komórek macierzystych) CD45 (antygenu związanego z leukocytem) co świadczy, te komórki te nie mają pochodzenia hematopoetycznego. Posiadają jednak takie same funkcje.

Aby stwierdzić czy doszło do zróżnicowania w komórki wydzielające insulinę, skupiska nowopowstałych komórek były identyfikowane na podstawie zawartości genów, dzięki metodzie analitycznej zwanej RT-PCR- reakcji łańcuchowej polimerazy DNA z analizą ilości powstającego produktu w czasie rzeczywistym. Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie rzeczywistym możliwe było dzięki znakowaniu starterów, sond oligonukleotydowych lub produktów amplifikacji cząsteczkami zdolnymi do fluorescencji (fluorochromami). W tym badaniu użyto barwnika fluorescencyjnego SYBR

Po zróżnicowaniu, wszystkie skupiska komórek wykazywały obecność szeregu genów jak np. białko Nestyna, które są typowe dla komórek wysp trzustkowych.

Transplantacja

Przeprowadzono próbę transplantacji nowo wyhodowanych komórek na myszach. Podano im streptozotycynę,(STZ) która wywołała u tych zwierząt cukrzycę. Wobec tego przeszczepiono im ok. 5milionów komórek produkujących insulinę, które znajdowały się w roztworze PBSu..

Poziom cukru w komórkach wydzielających insulinę wszczepionych do myszy obniżył się po 3 dniach, zaś poziom cukru u myszy kontrolnej z wstrzykniętym tylko PBSem wzrastał. W 30 dni po przeszczepie, chociaż poziom cukru we krwi przeszczepionej myszy nie obniżył się do normalnego poziomu tj poniżej 120, to nie był już obserwowany wzrostu jak myszy z cukrzycą gdzie dla kontroli wstrzyknięto PBS. Ten eksperyment pokazał, że nie było insuliny w komórkach myszy kontrolnej, ale była w grupie przeszczepionych komórek IPCs. W przedstawionym tu eksperymencie komórki produkujące insulinę utrzymywały wprawdzie cukier na względnie stałym poziome, ale nie mogły pomóc w obniżeniu jego poziomu. Mogło to być spowodowane tym, że dawka przeszczepionych komórek była zbyt mała, wobec czego efekt leczenia cukrzycy nie był dobry. Wobec tego powinno się spróbować przeszczepić komórki w większej ich licznie.

Wnioski:

Podsumowując mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej mogą różnicować się w funkcjonalne wyspopodobne komórki trzustkowe w warunkach poza organizmem (In vitro).

Należy pamiętać o tym, iż pomimo możliwości ich różnicowania istnieją nieraz przeszkody uniemożliwiające ich kliniczne zastosowanie. Jako, że komórki te nie pochodzą od pacjentów z cukrzycą, transplantowane im mogą zostać odrzucone. Takie ryzyko jest minimalizowane w przypadku przeszczepów autologicznych, gdzie po namnożeniu mezenchymalnych komórek macierzystych zostają one przeszczepiane z powrotem tym pacjentom. Wówczas ich wysoki potencjał proliferacji i uniknięcie odrzucenia umożliwią obiecującą terapię cukrzycy.

Zdjęcia:

a) chromatogram

Załączony rysunek przedstawia wynik chromatografii cieczowej, techniki analitycznej służącej m. in. do identyfikacji substancji chemicznych, w tym przypadku insuliny. Pierwszy wykres odnosi się do myszy kontrolnej, drugi zaś do myszy której podano komórki produkujące insulinę. Niebieska linia oznacza standardową próbkę insuliny, zaś czerwona mysią surowicę. U myszy zdrowej insulina jest wykrywana po czasie ok. 29minut. W przypadku myszy kontrolnej, u której nie stwierdzono występowania insuliny linia oznaczająca surowicę przebiega idealnie poziomo, podczas gdy na 2 schemacie dotyczącym myszy z komórkami które insulinę wydzielają widzimy lekkie wahnięcie linii czerwonej co wskazuje na obecność insuliny w jej komórkach.

b)

Zdjęcia pokazane na tym slajdzie ukazują morfologiczne zmiany zachodzące w różnicujących się komórkach krwi pępowinowej.

Rysunek A – przedstawia komórki po 9 dniach hodowli, można tu zaobserwować tworzenie się agregatów, większych skupisk komórek

Rysunek B- to hodowla 21-dniowaz wyraźnymi, bardziej skondensowanymi skupiskami komórek

Rysunek C – skupiska komórek zaobserwowanych w normalnym świetle

D, E – te same skupiska komórek wybarwione przy pomocy barwnika fluorescencyjnego Hoechsta 3342 i FITC (izotiocyjanianu fluoresceiny)