Sprawozdanie

Inżynieria bioreaktorów – laboratorium

„Zajęcia komputerowe – wyznaczanie parametrów kinetycznych”

Wstęp teoretyczny

Celem ćwiczenia było wyznaczenie parametrów kinetycznych równania na podstawie danych z przeprowadzonego doświadczenia, korzystając z dwóch metod - biochemicznej i przemysłowej:

1. Metoda biochemiczna – początkowych szybkości reakcji

W metodzie tej przeprowadza się doświadczenie, opierając się na założeniach kinetyki Michaelisa – Menten, tj.:

• Enzym i substrat reagują odwracalnie, tworząc kompleks enzym – substrat [1,2].

• Założenie prędkości początkowej – ignoruje się reakcje, w których enzym i produkt mogłyby odtworzyć kompleks enzym – substrat i ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat. Założenie to jest spełnione w początkowym etapie reakcji przy początkowej szybkości, zanim stężenie produktu stanie się znaczące [1,2].

• Założenie stanu stacjonarnego – stężenie kompleksu enzym – substrat szybko osiąga stałą wartość oraz szybkość tworzenia kompleksu enzym – substrat jest równa szybkości jego rozpadu [1,2].

• W reakcji uczestniczy tylko jeden substrat lub jeśli reakcja jest wielosubstratowa, stężenie tylko jednego substratu zmienia się, a wszystkich innych zachowuje stałą wartość [2].

• Stężenie substratu jest większe niż stężenie enzymu, a stężenie enzymu pozostaje stałe w czasie prowadzenia doświadczenia [1].

C_s,max ∼ 20 * K_M ∼ 95% V_max

C_{s, min} ≥ 0,5 * K_M,

Gdzie K_M – stała Michaelisa, V_max – szybkość maksymalna

• Temperatura, pH, siła jonowa są stałe [2].

Temperatura powinna być o 5 – 10 °C niższa niż temperatura optymalna, aby nie spowodować denaturacji części enzymu.

pH natomiast powinno być utrzymywane na poziomie optymalnym dla danego enzymu. Wtedy enzym jest najbardziej stabilny.

Przygotowując się do przeprowadzenia tego doświadczenia należy dobrać odpowiedni czas reakcji. Reakcje najlepiej przerwać, gdy stopień przereagowania substratu nie będzie większy niż 5%. Z otrzymanych wyników sporządza się wykres zależności r = f(C_s). Jeżeli wykres jest zgodny z oczekiwaniami, oznacza to, że reakcja przebiega zgodnie z kinetyką Michaelisa – Menten (MM). Z linearyzacji tego wykresu sporządza się wykres Lineweavera – Burka (LB) zależności 1/r = f(1/C_s) i wyznacza z równania prostej parametry K_M (stała Michaelisa) oraz V_max (szybkość maksymalna reakcji).

Natomiast jeżeli zarówno kształt wykresu MM i LB odbiega od standardowego, świadczy to o niestandardowej kinetyce, co więcej enzym jest hamowany przez inhibitor. Wiadomo, że w reakcji brał udział tylko substrat i enzym, więc inhibitorem może być produkt lub substrat reakcji. Z tych danych wyklucza się inhibicję produktem, gdyż doświadczenie rozpatrywane jest przy stężeniu początkowym, gdy nie powstał jeszcze produkt. W takim przypadku wykres MM ma taką samą postać, jak dla reakcji bez inhibitora.

W celu zweryfikowania podejrzenia o inhibicję sporządza się wykres zależności czasu rzeczywistego reakcji od stężenia substratu i porównuje z wykresem zależności czasu modelowego od stężenia substratu. Czas modelowy dla danej reakcji wylicza się z postaci całkowej równania Michaelisa – Menten:

$$t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} \right)$$

gdzie:

t – czas

C_0,s – stężenie początkowe substratu

C_s – stężenie substratu po czasie t

V_max – szybkość maksymalna reakcji

K_M – stała Michaelisa

Jeżeli oba wykresy się pokrywają, to w reakcji nie bierze udział inhibitor. Natomiast jeżeli się nie pokrywają, to reakcja jest hamowana. Można w ten sposób potwierdzić inhibicję substratem i wykryć inhibicję produktem.

Parametry kinetyczne reakcji można także wyznaczyć regresją nieliniową, korzystając z programu Origin Pro 8.0.

W programie tworzy się wykres MM, wprowadza szacunkowe wartości K_M i V_max oraz równanie krzywej: $V = \frac{V_{\max} \bullet C_{s}}{K_{M} + C_{s}}$ . Program z regresji nieliniowej wyznacza dokładne parametry wraz z błędem analitycznym.

W taki sam sposób można rozpatrzyć reakcję z inhibitorem, którym jest substrat. Wprowadza się szacunkowe wartości K_M, V_max oraz K_is (parametr charakterystyczny dla inhibicji substratowej, nie jest się go w stanie wyznaczyć z regresji liniowej, dlatego przyjmuje się, że musi być większy od K_M). Równanie krzywej ma postać : $V = \frac{V_{\max} \bullet C_{s}}{K_{M} + C_{s} + \frac{C_{s}^{2}}{K_{\text{is}}}}$, a z regresji nieliniowej otrzymuje się dokładne wartości parametrów kinetycznych.

Niestety dla inhibicji produktem nie można zastosować tej metody, ponieważ wykres MM ma taką samą postać jak dla reakcji bez inhibitora i nie uzyska się wartości parametrów dla reakcji hamowanej produktem. Alternatywą dla obliczenia tych wartości jest inna metoda – metoda przemysłowa.

1. Metoda przemysłowa

Metoda ta stosowana jest w przemyśle, ponieważ nie uwzględnia się tu założeń kinetyki Michaelisa – Menten. Badany jest wpływ każdego ze składników reakcji. Nie przyjmuje się założenia początkowych szybkości reakcji, czyli sprawdzane jest także oddziaływanie produktu. Można więc wyznaczyć parametry dla reakcji hamowanej produktem. Reakcja nie jest przerywana, po początkowym przereagowaniu substratu, lecz jest prowadzona do końca, aż do wyczerpania substratu. Jest się tutaj nastawionym na uzyskanie maksymalnej ilości produktu.

Nie można tu wyznaczyć parametrów kinetycznych z regresji liniowej i wykresu Michaelisa –Menten. Korzysta się z programu Origin, gdzie tworzony jest wykres Cs = f(t). Zauważa się tutaj spadek stężenia substratu w czasie. Jednak bez dokładnej wiedzy o enzymie, nie można wyznaczyć szukanych parametrów. Należy wiedzieć, czy w reakcji bierze udział inhibitor, aby zastosować odpowiednie równanie krzywej, z której zostaną wyznaczone stałe.

• Dla reakcji bez inhibitora $t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} \right)$

• Dla inhibicji substratem $t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \left( \frac{1}{2 \bullet K_{\text{is}}} \bullet \left( C_{0,s}^{2} - C_{s}^{2} \right) \right) \right)$

• Dla inhibicji produktem $t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \left( \left( 1 - \frac{\text{Km}}{\text{Ki}} \right) \bullet \left( C_{0,s} - C_{s} \right) \right) \right)$

gdzie:

t – czas

C_0,s – stężenie początkowe substratu

C_s – stężenie substratu po czasie t

V_max – szybkość maksymalna reakcji

K_M – stała Michaelisa

K_is – stała dla inhibicji substratem

K_i – stała dla inhibicji produktem

Podczas wyznaczania parametrów także niezbędna jest znajomość w przybliżeniu wartości K_M i V_max oraz stałych dla inhibicji. Można je odnaleźć w literaturze lub wykonać kilka pomiarów przy założeniu początkowych szybkości reakcji i oszacować z kinetyki Michaelisa – Menten.

Program Origin z regresji nieliniowej wyznacza dokładne wartości parametrów kinetycznych.

Opracowanie wyników

Wyznaczanie parametrów kinetycznych równania metodą biochemiczną

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji przebiegającej zgodnie z kinetyką reakcji Michaelisa-Menten.

1. Wyznaczenie funkcji r = f(C_s) na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wartości C_s i r:

Cs	r
0,10	0,021
0,20	0,038
0,30	0,050
0,50	0,068
0,75	0,083
1,00	0,094
1,50	0,107
2,00	0,115
2,50	0,121
3,00	0,125
4,00	0,130
5,00	0,134
7,50	0,139
10,00	0,142
15,00	0,144
20,00	0,146

1. Otrzymanie wykresu Lineweavera–Burka na podstawie linearyzacji wykresu Michaelisa–Menten:

1/Cs	1/r
10,00	46,67
5,00	26,67
3,33	20,00
2,00	14,67
1,33	12,00
1,00	10,67
0,67	9,33
0,50	8,67
0,40	8,27
0,33	8,00
0,25	7,67
0,20	7,47
0,13	7,20
0,10	7,07
0,07	6,93
0,05	6,87

Przedstawione wykresy Michaelisa – Menten oraz Lineweavera – Burka są zgodne z oczekiwaniami. Oznacza to, że reakcja przebiegała zgodnie z założeniami kinetyki Michaelisa – Menten.

1. Wyznaczenie parametrów kinetycznych K_M i V_max na podstawie równania krzywej z wykresu Lineweavera – Burka:

$$\frac{1}{V} = \frac{K_{M}}{V_{\max}} \bullet \frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}}\ \ \ < = > \ \ \ \frac{1}{r} = 4 \bullet \frac{1}{C_{s}} + \ 6,667$$

$$\frac{1}{V_{\max}} = 6,667\ \ \ = > \ \ \ V_{\max} = 0,150$$

$$\frac{K_{M}}{V_{\max}} = 4\ \ \ = > \ \ \ K_{M} = 0,600$$

1. Otrzymane wartości K_M i V_max metodą regresji nieliniowej:

V_max = 0, 150 ± 9, 816 • 10⁻¹⁷

K_M = 0, 600 ± 1, 781 • 10⁻¹⁵

1. Weryfikacja danych w reaktorze okresowym. Wyznaczenie czasu modelowego:

$$t_{\text{modelowy}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet K_{M} \bullet ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s}$$

C_0, s = 30

t	Cp	Cs	tmodelowy
0	0,00	30,00	0,0
1	0,15	29,85	1,0
2	0,30	29,70	2,0
3	0,45	29,55	3,1
5	0,75	29,25	5,1
10	1,50	28,50	10,2
15	2,25	27,75	15,3
20	2,90	27,10	19,7
25	3,70	26,30	25,2
30	4,50	25,50	30,7
40	5,90	24,10	40,2
50	7,30	22,70	49,8
60	8,70	21,30	59,4
79	11,60	18,40	79,3
100	14,60	15,40	100,0
120	17,50	12,50	120,2
150	22,00	8,00	152,0
180	25,70	4,30	179,1
196	28,00	2,00	197,5
210	29,30	0,70	210,4
219	29,80	0,20	218,7
222	29,90	0,10	222,1
225	29,95	0,05	225,3

1. Otrzymanie wykresu zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie (t = f(C_s)) oraz wykresu zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (t_modelowy = f(C_s)).

Przedstawione wykresy pokrywają się. Ta obserwacja potwierdza, że w reakcji nie bierze udział inhibitor.

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji w przypadku inhibicji substratem.

1. Wyznaczenie funkcji r = f(C_s) na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wartości C_s i r:

Cs	r
0,1	0,021
0,2	0,037
0,3	0,050
0,5	0,068
0,8	0,083
1,0	0,093
1,5	0,105
2,0	0,112
2,5	0,116
3,0	0,119
4,0	0,122
5,0	0,123
7,5	0,122
10,0	0,119
15,0	0,112
20,0	0,105
25,0	0,098
30,0	0,093
35,0	0,087
40,0	0,083

1. Otrzymanie wykresu Lineweavera–Burka na podstawie linearyzacji wykresu Michaelisa–Menten:

1/Cs	1/r
10,00	46,68
5,00	26,69
3,33	20,04
2,00	14,73
1,33	12,10
1,00	10,80
0,67	9,53
0,50	8,93
0,40	8,60
0,33	8,40
0,25	8,20
0,20	8,13
0,13	8,20
0,10	8,40
0,07	8,93
0,05	9,53
0,04	10,16
0,03	10,80
0,03	11,45
0,03	12,10

Kształty przedstawionych wykresów (Michaelisa – Menten i Lineweavera – Burka) znacznie odbiegają od standardowych. Świadczy to o niestandardowej kinetyce, enzym jest hamowany przez inhibitor. W tym przypadku szybkość reakcji maleje wraz ze wzrostem stężenia substratu. Występuje tutaj inhibicja substratowa.

1. Przeprowadzenie poprawnej linearyzacji:

W celu wyznaczenia parametrów K_M i V_max do wykresu Lineweavera – Burka brano punkty, które tworzyły odcinek prosty tj. punkty odnoszące się do małego stężenia substratu.

1/Cs	1/r
10,00	46,68
5,00	26,69
3,33	20,04
2,00	14,73
1,33	12,10
1,00	10,80
0,67	9,53
0,50	8,93
0,40	8,60
0,33	8,40
0,25	8,20
0,20	8,13

1. Wyznaczenie parametrów kinetycznych K_M i V_max na podstawie równania krzywej z wykresu Lineweavera – Burka:

V_max = 0, 143

K_M = 0, 565

1. Otrzymane wartości K_M i V_max metodą regresji nieliniowej:

V_max = 0, 150 ± 1, 226 • 10⁻¹⁶

K_M = 0, 600 ± 1, 595 • 10⁻¹⁵

K_is = 50 ± 1, 556 • 10⁻¹³

1. Weryfikacja danych w reaktorze okresowym. Wyznaczenie czasu modelowego:

$$t_{\text{modelowy}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet K_{M} \bullet ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \frac{1}{{2 \bullet K}_{\text{is}}} \bullet \left( C_{0,s}^{2} - C_{s}^{2} \right)$$

C_0, s = 30

t	Cp	Cs	tmodelowy
0	0,00	30,00	0,0
2,2	0,15	29,85	1,1
4	0,30	29,70	2,1
6	0,45	29,55	3,2
11	0,75	29,25	5,3
19	1,50	28,50	10,7
26	2,25	27,75	16,0
34	2,90	27,10	20,7
42	3,70	26,30	26,4
52	4,50	25,50	32,1
66	5,90	24,10	42,1
80	7,30	22,70	52,2
97	8,70	21,30	62,2
123	11,60	18,40	83,1
150	14,60	15,40	104,7
176	17,50	12,50	125,8
211	22,00	8,00	159,1
239	25,70	4,30	187,4
245	26,50	3,50	193,8
256	27,80	2,20	204,7
260	28,30	1,70	209,2
267	29,00	1,00	216,2
273	29,50	0,50	222,5
278	29,80	0,20	228,2

1. Otrzymanie wykresu zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie (t = f(C_s)) oraz wykresu zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (t_modelowy = f(C_s)).

Przedstawione wykresy nie pokrywają się. Świadczy to o tym, że w reakcji bierze udział inhibitor, którym jest substrat. Enzym pracuje wolniej niż przewiduje to wykres modelowy. Jednakże im ilość substratu zmniejsza się wraz z biegiem czasu, tym reakcja biegnie szybciej.

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji w przypadku inhibicji produktem.

1. Wyznaczenie funkcji r = f(C_s) na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wartości C_s i r:

Cs	r
0,1	0,021
0,2	0,038
0,3	0,050
0,5	0,068
0,8	0,083
1,0	0,094
1,5	0,107
2,0	0,115
2,5	0,121
3,0	0,125
4,0	0,130
5,0	0,134
7,5	0,139
10,0	0,142
15,0	0,144
20,0	0,146
30,0	0,147
40,0	0,148

1. Otrzymanie wykresu Lineweavera–Burka na podstawie linearyzacji wykresu Michaelisa–Menten:

1/Cs	1/r
10,00	46,67
5,00	26,67
3,33	20,00
2,00	14,67
1,33	12,00
1,00	10,67
0,67	9,33
0,50	8,67
0,40	8,27
0,33	8,00
0,25	7,67
0,20	7,47
0,13	7,20
0,10	7,07
0,07	6,93
0,05	6,87
0,03	6,80
0,03	6,77

Przedstawione wykresy tj. wykres Michaelisa – Menten oraz Lineweavera – Burka, są zgodne z oczekiwaniami. Oznacza to, że reakcja przebiegała zgodnie z założeniami kinetyki Michaelisa – Menten.

1. Wyznaczenie parametrów kinetycznych K_M i V_max na podstawie równania krzywej z wykresu Lineweavera – Burka:

V_max = 0, 150

K_M = 0, 600

1. Weryfikacja danych w reaktorze okresowym. Wyznaczenie czasu modelowego:

$$t_{\text{modelowy}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet K_{M} \bullet ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s}$$

C_0, s = 30

t	Cp	Cs	tmodelowy
0,0	0,0	30,00	0,00
1,0	0,2	29,85	1,02
2,0	0,3	29,70	2,04
3,1	0,5	29,55	3,06
5,1	0,8	29,25	5,10
10,4	1,5	28,50	10,21
15,8	2,3	27,75	15,31
20,5	2,9	27,10	19,74
26,4	3,7	26,30	25,19
32,5	4,5	25,50	30,65
43,6	5,9	24,10	40,21
55,1	7,3	22,70	49,78
67,2	8,7	21,30	59,37
94,6	11,6	18,40	79,29
127,0	14,6	15,40	100,00
164,0	17,5	12,50	120,17
240,2	22,0	8,00	151,95
342,0	25,7	4,30	179,10
463,7	28,0	2,00	197,50
627,5	29,3	0,70	210,36
821,3	29,8	0,20	218,71
928,2	29,9	0,10	222,15
1035,0	30,0	0,05	225,25

1. Otrzymanie wykresu zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie (t = f(C_s)) oraz wykresu zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (t_modelowy = f(C_s)).

Przedstawione wykresy nie pokrywają się. Świadczy to o tym, że w reakcji bierze udział inhibitor, którym jest produkt. Enzym pracuje dużo wolniej niż przewiduje to wykres modelowy. Reakcja osiąga większą szybkość dopiero w wyższych stężeniach substratu.

Wyznaczanie parametrów kinetycznych równania metodą przemysłową.

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji przebiegającej zgodnie z kinetyką reakcji Michaelisa-Menten.

1. Wyznaczenie funkcji r = f(C_s) na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wartości C_s i r:

Cs	t
30	0
29,85	1
29,7	2
29,55	3
29,25	5
28,5	10
27,75	15
27,1	20
26,3	25
25,5	30
24,1	40
22,7	50
21,3	60
18,4	79
15,4	100
12,5	120
8	150
4,3	180
2	196
0,7	210
0,2	219
0,1	222
0,05	225

1. Otrzymane wartości K_M i V_max metodą regresji nieliniowej:

V_max = 0, 151 ± 3, 965 • 10⁻⁴

K_M = 0, 622 ± 0, 019

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji w przypadku inhibicji substratem.

1. Wyznaczenie funkcji r = f(C_s) na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wartości C_s i r:

Cs	t
30	0
29,85	2,2
29,7	4
29,55	6
29,25	11
28,5	19
27,75	26
27,1	34
26,3	42
25,5	52
24,1	66
22,7	80
21,3	97
18,4	123
15,4	150
12,5	176
8	211
4,3	239
3,5	245
2,2	256
1,7	260
1	267
0,5	273
0,2	278

1. Otrzymane wartości K_M, V_max oraz K_is metodą regresji nieliniowej:

V_max = 0, 189 ± 0, 005

K_M = 0, 978 ± 0, 112

K_is = 24, 914 ± 1, 449

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji w przypadku inhibicji produktem.

1. Wyznaczenie funkcji r = f(C_s) na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wartości C_s i r:

Cs	t
30	0,0
29,85	1,0
29,7	2,0
29,55	3,1
29,25	5,1
28,5	10,4
27,75	15,8
27,1	20,5
26,3	26,4
25,5	32,5
24,1	43,6
22,7	55,1
21,3	67,2
18,4	94,6
15,4	127,0
12,5	164,0
8	240,2
4,3	342,0
2	463,7
0,7	627,5
0,2	821,3
0,1	928,2
0,05	1035,0

1. Otrzymane wartości K_M, V_max oraz K_i metodą regresji nieliniowej:

V_max = 0, 149 ± 3, 22 • 10⁻¹¹

K_M = 0, 426 ± 6, 544 • 10⁻⁹

K_i = 0, 567 ± 8, 793 • 10⁻⁹

Wnioski

Zarówno metodą biochemiczną, jak i przemysłową wyznaczono parametry równania kinetycznego. Metoda biochemiczna jest bardziej dokładna, ponieważ opiera się na założeniach Michaelisa – Menten. Jednak jest trudniejsza i zajmuje więcej czasu niż metoda przemysłowa. Także ze względu na pomiary przy początkowej szybkości reakcji, gdzie nie obserwuje się obecności produktu, nie można wyznaczyć parametrów dla inhibicji produktem, korzystając z tej metody.

Mimo, że metoda przemysłowa jest mniej dokładna i cechuje się większym błędem, używa się jej w przemyśle ze względu na łatwe wykonanie. Nie korzysta się tu z kinetyki Michaelisa – Menten, ponieważ w przemyśle ważne jest rozpatrzenie całej reakcji, a nie tylko etap gdzie jest niskie przereagowaniu substratu.

W metodzie przemysłowej opiera się tylko na korzystaniu z regresji nieliniowej, ale niezbędne jest podanie wstępnie przypuszczalnych wartości parametrów. W zależności z jaką dokładnością podaliśmy stałe, wyniki mogą być obarczone dużym błędem.

Rozpatrując reakcję bez inhibitora, metodą biochemiczną wyznaczone parametry z wykresu Lineweavera – Burka pokrywają się z wartościami z regresji nieliniowej. Także w przypadku inhibicji substratem oszacowane wcześniej wartości stałych zmniejszają błąd uzyskanych wyników.

Wyznaczanie parametrów kinetycznych z regresji nieliniowej jest szczególnie niezbędne w przypadku reakcji z inhibitorem, ponieważ poprzez regresję liniową nie uzyska się wartości stałej inhibicji K_is w metodzie biochemicznej. W metodzie przemysłowej korzysta się tylko z regresji nieliniowej, ale im większa liczba szukanych stałych, tym większy błąd otrzymanych wartości parametrów. Dlatego można z kinetyki Michaelisa - Menten oszacować K_m i V_max, przeprowadzając przykładową reakcję zgodnie z danymi założeniami, a regresją nieliniową wyznaczyć parametry kinetyczne dla tej inhibicji.

Literatura

[1] Berg JM., Stryer L., Tymoczko JL., Biochemia, PWN, Warszawa 2003, 201-203

[2] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych – Biochemia I, Ćwiczenie A – Kinetyka enzymatyczna I, Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Biochemii, Wrocław 2010, 6-9