Laboratorium

Inżynieria Bioreaktorów

Semestr letni 2013/2014

Zajęcia komputerowe

Prowadzący: Dr Hab. Jolanta Bryjak, Prof. Nadzw.

30.04.2014r.

Grupa 4

Aleksandra Ruszkowska 193206

Natalia Lisowska 193398

I. Wstęp teoretyczny

Reaktor okresowy (periodyczny)

Jest to reaktor, w którym przeprowadzamy reakcję w fazie ciekłej, a objętość nie ulega zmianie[1]. Substraty do reaktora dostarczone są jednorazowo, a wewnątrz następuje intensywne mieszanie. Po zakończeniu reakcji aparat jest opróżniany. Proces biegnie w warunkach nieustalonych, wobec czego jego kontrola jest bardzo trudna. Stężenie w reaktorze zmienia się w czasie i jest wyrównywane w całej objętości reaktora. Wraz z postępem reakcji ilość substratu zmniejsza się, co powoduje spadek szybkości reakcji. W reaktorze periodycznym występuje czas jałowy- czas bezproduktywny, w którym wykonywane są czynności dodatkowe, jak mycie reaktora. Sterylizacja jest bardzo pracochłonna, ale nie ma problemu z jej wykonaniem. Zaletą jest z pewnością duża szybkość reakcji, charakteryzująca tego typu reaktor, jak i duża przydatność mikrobiologiczna. Użyteczny jest nawet przy dużych, złożonych wymaganiach hodowli[2][3].

Kinetyka enzymatyczna

Kinetykę reakcji katalizowanych enzymatycznie możemy badać dzięki zmianom szybkości reakcji zachodzącym równocześnie ze zmianą stężeń substratów i produktów[4].

Jeżeli stężenie substratu jest zbyt niskie, to nie wypełni on wszystkich miejsc wiążących na enzymie, co spowoduje iż biokatalizator nie osiągnie swojej maksymalnej aktywności katalitycznej. W przypadku, gdy stężenie substratu jest bardzo duże, wszystkie cząsteczki enzymu zostają wysycone, tworząc kompleks enzym- substrat i zaobserwujemy maksymalną aktywność katalityczną. Od tego momentu zwiększanie stężenia substratu nie wpłynie już na szybkość reakcji, gdyż osiągnęła swoje maksimum. [5]

Większość enzymów działa zgodnie z kinetyką Michaelis’a-Menten. Aby ten działał poprawnie, musi spełniać poniższe założenia:

1. Założenie stanu stacjonarnego.

Kompleks ES powstaje z taką samą szybkością z jaką może wrócić do E+S lub przekształcić się do E+P, z czego wynika, że zmiana stężenia [ES] w czasie wynosi 0.

2. Powstawanie kompleksu ES jest reakcją odwracalną.

3. Założenie prędkości początkowej.

Enzym przyspiesza reakcję w obu kierunkach, wobec czego pomijamy możliwość odtworzenia z E+P kompleksu ES, gdyż szybkość takiej reakcji byłaby proporcjonalna do stężenia produktu, a jest ono na początku reakcji prawie równe zeru. Dla takiego założenia całkowitą ilość enzymu możemy policzyć jako sumę stężeń wolnego enzymu i kompleksu enzym-substrat[4].

Powyższe założenia możemy zobrazować jako [4]:

$E + S\begin{matrix} k_{1} \\ \rightleftarrows \\ k_{- 1} \\ \end{matrix}\ \text{ES}{\ E + P}$ (a)

gdzie:

E- enzym,

S- substrat,

P- produkt,

ES- kompleks enzym- substrat,

k₁- stała szybkości reakcji powstawania ES,

k_-1-stała szybkości reakcji rozpadu ES,

k₂-stała szybkości reakcji powstawania E+P.

Biorąc pod uwagę wyżej wymienione założenia oraz schemat reakcji (a), możemy skorzystać ze wzoru (równanie Michaelis’a-Menten):

$r = \frac{Vmax*Cs}{Km + Cs}$ (b)

gdzie:

r- szybkość reakcji ,

Vmax- maksymalna szybkość reakcji,

Km- stała Michaelis’a,

Cs- stężenie substratu.

Km i Vmax są to parametry kinetyczne równania. Stała Michaelis’a (Km) to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej (Vmax)[4]_.

Tą zależność doskonale ukazuje poniższy wykres:

Z wykresu 1. niestety nie jesteśmy w stanie odczytać parametrów kinetycznych, tj. K_M i Vmax, z powodu hiperbolicznego kształtu funkcji, dlatego trzeba zastosować linearyzację. Obecnie najczęściej stosowane linearyzacje to: Lineweaver’a-Burk’a , którą przedstawimy poniżej, a także Hanes’a-Woolf’a i Woolf’a-Augustinsson-Hofstee[6].

Wykres2. Linearyzacja równania Michaelis’a-Menten według Lineweaver’a- Burk’a

Autorstwo własne.

Przekształcając równanie Michaelis’a- Menten otrzymujemy zależność:

$\frac{1}{r} = \frac{\text{Km}}{\text{Vmax}}*\frac{1}{\text{Cs}} + \frac{1}{\text{Vmax}}$ (c)

która daje równanie prostej y=ax+b (y=1/V , x= 1/Cs, Km/Vmax- nachylenie, b=1/Vmax).

Wszelkie odstępstwa od liniowości świadczą o tym, że enzym nie działa zgodnie modelem Michaelis’a- Menten, a prawdopodobnie należy do enzymów allosterycznych[4].

Osoby zajmujące się na co dzień badaniem kinetyki enzymatycznej, mają do dyspozycji 2 metody: biochemiczną i przemysłową i stosują je w zależności od celu swoich badań:

• Metoda biochemiczna jest metodą stosowaną wtedy, gdy mamy na celu otrzymanie dokładnych parametrów kinetycznych, pracując zgodnie ze wszystkimi założeniami kientyki Michaelis’a-Menten. Jest to metoda konieczna do badania nowo odkrytych biokatalizatorów wobec czego wymaga dokładnego opisania.

Stosując tą metodę możemy wyznaczyć parametry kinetyczne i opisać je w dwojaki sposób:

• używając regresji liniowej i równania (c), dołączając odpowiednie wyniki doświadczenia i obrazujący je wykres (o ile jesteśmy pewni, że nie występuje żadna inhibicja),

• używając regresji nieliniowej i równania (b), dołączając odpowiednie wyniki doświadczenia wraz z odchyleniami[7].

• Metoda przemysłowa jest metodą mało dokładną, stosowaną aby otrzymać jak największą ilość produktu w jak najkrótszym czasie, nie spełnia założeń kinetyki Michaelis’a- Menten. Jej stosowanie jest ściśle zależne od nakładów finansowych, którymi dysponujemy oraz wymaga podstawowej wiedzy na temat wykorzystywanego enzymu. Nie można jej wykorzystywać do opisywania nowego biokatalizatora. Przy wyznaczaniu parametrów kinetycznych używamy regresji nieliniowej oraz całkowej postaci równania Michaelis’a – Meten:

$t = \left( \frac{1}{\text{Vmax}} \right)*\left( Km*ln\left( \frac{Cs0}{\text{Cs}} \right) + Cs0 - Cs \right)$ (d)

Ze wzoru (d) wyznaczamy czas modelowy, który porównujemy z naszym czasem eksperymentalnym. Jeżeli na wykresie krzywe się pokryją świadczy to o braku inhibicji, natomiast jeżeli zaobserwujemy miedzy nimi rozbieżność, to oznacza, że występuje jakiś rodzaj hamowania. Przedstawiając wyniki uzyskane tą metodą możemy podać tylko wartości liczbowe wraz z odchyleniami [7].

II. Cel ćwiczenia

Zapoznanie się z metodami wyznaczania parametrów kinetycznych reakcji katalizowanych enzymatycznie(regresja liniowa- Excel i nieliniowa w programie OriginPro 9.0).

III. Obliczenia i wykresy

UWAGA: W obliczeniach użyto danej wartości Cs0=30.

1. Reakcja bez inhibicji, według modelu Michaelis’a- Menten:

a) Obliczenie K_M i V_max z regresji liniowej:

Cs	r	1/Cs	1/r
0,10	0,021	10,000	46,667
0,20	0,038	5,000	26,667
0,30	0,050	3,333	20,000
0,50	0,068	2,000	14,667
0,75	0,083	1,333	12,000
1,00	0,094	1,000	10,667
1,50	0,107	0,667	9,333
2,00	0,115	0,500	8,667
2,50	0,121	0,400	8,267
3,00	0,125	0,333	8,000
4,00	0,130	0,250	7,667
5,00	0,134	0,200	7,467
7,50	0,139	0,133	7,200
10,00	0,142	0,100	7,067
15,00	0,144	0,067	6,933
20,00	0,146	0,050	6,867
25,00	0,146	0,040	6,827

Tabela 1.Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu.

Możemy dokonać linearyzacji Wykresu 1. stosując wykres Lineweaver’a-Burk’a (Wykres 2.), który opisany jest poniższym równaniem:

$$\frac{1}{r} = \frac{K_{M}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}\ }$$

Wykres 2.

Korzystając z równania funkcji: y=4x+6,6667 możemy obliczyć parametry kinetyczne:

V_max i K_M:

Vmax	Km
0,15	0,60

$\frac{1}{\text{Vmax}} = 6,6667$, stąd:

Vmax = 0, 15

$\frac{\text{Km}}{\text{Vmax}} = 4$, stąd:

Km = 4 * Vmax = 4 * 0, 15 = 0, 60

b) Obliczenie parametrów kinetycznych: K_M i V_max z regresji nieliniowej:

1. Metoda biochemiczna

W tej metodzie posługujemy się równaniem Michaelis’a- Menten:

$$r = \frac{Vmax*Cs}{Km + Cs}$$

Km = 0, 6 ± 1, 6232 * 10⁻¹⁵

Vmax = 0, 15 ± 8, 4996 * 10⁻¹⁷

1. Metoda przemysłowa

W tej metodzie wykorzystujemy całkową postać równania Michaelis’a-Menten:

$t = \left( \frac{1}{\text{Vmax}} \right)*\left( \text{Km}*\ln\left( \frac{\text{Cs}0}{\text{Cs}} \right) + \text{Cs}0 - \text{Cs} \right)$ (e)

Km = 0, 62195 ± 0, 01996

Vmax = 0, 15066 ± 3, 96488 * 10⁻⁴

Cs	tmodel	teksp
30	0,0	0
29,85	1,0	1
29,7	2,0	2
29,55	3,1	3
29,25	5,1	5
28,5	10,2	10
27,75	15,3	15
27,1	19,7	20
26,3	25,2	25
25,5	30,7	30
24,1	40,2	40
22,7	49,8	50
21,3	59,4	60
18,4	79,3	79
15,4	100,0	100
12,5	120,2	120
8	152,0	150
4,3	179,1	180
2	197,5	196
0,7	210,4	210
0,2	218,7	219
0,1	222,1	222
0,05	225,3	225

Wykres 3.

Na podstawie Wykresu 3. możemy wnioskować, że mamy do czynienia z reakcją bez inhibicji, ponieważ niebieska linia czasu modelowego, wyznaczonego w reaktorze okresowym, pokrywa się z czerwonymi punktami oznaczającymi czas eksperymentalny. Jest to reakcja enzymatyczna dająca się opisać podstawowym modelem Michaelis’a- Menten.

1. Reakcja z inhibicją substratem:

a) Obliczenie K_M i V_max z regresji liniowej:

Cs	r	1/Cs	1/r
0,1	0,021	10,00	46,68
0,2	0,037	5,00	26,69
0,3	0,050	3,33	20,04
0,5	0,068	2,00	14,73
0,8	0,083	1,33	12,10
1,0	0,093	1,00	10,80
1,5	0,105	0,67	9,53
2,0	0,112	0,50	8,93
2,5	0,116	0,40	8,60
3,0	0,119	0,33	8,40
3,5	0,121	0,29	8,28
4,0	0,122	0,25	8,20
5,0	0,123	0,20	8,13
7,5	0,122	0,13	8,20
10,0	0,119	0,10	8,40
15,0	0,112	0,07	8,93
20,0	0,105	0,05	9,53
25,0	0,098	0,04	10,16
30,0	0,093	0,03	10,80
35,0	0,087	0,03	11,45
40,0	0,083	0,03	12,10

Tabela 3. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu.

Wykres 4.

Analizując Wykres 4. możemy stwierdzić, że mamy do czynienia z modelem odbiegającym od kinetyki Michaelis’a- Menten, ponieważ szybkość reakcji po osiągnięciu maksimum, przy stężeniu około 5,0, nie osiąga stałej wartości, ale widocznie maleje.

Znów dokonujemy linearyzacji Wykresu 4. stosując wykres Lineweaver’a-Burk’a (Wykres 5.):

Wykres 5.

Dane po odrzuceniu punktów sięgają wartości: 1/ Cs=0,25 i 1/r=8,20.

Wykres 6.

Linearyzacja wykresu nie wskazuje na występowanie jakiejkolwiek inhibicji.

Korzystając z równania funkcji: y=3,9585x+6,9685 możemy obliczyć parametry kinetyczne: V_max i K_M:

Vmax	Km
0,144	0,591

$\frac{1}{\text{Vmax}} = 6,9685$, stąd:

Vmax = 0, 144

$\frac{\text{Km}}{\text{Vmax}} = 3,9585$, stąd:

Km = Vmax * 3, 9585 = 0, 144 * 3, 9585 = 0, 591

b) Obliczenie parametrów kinetycznych: K_M, K_is i V_max z regresji nieliniowej:

a. Metoda biochemiczna:

W tej metodzie wykorzystujemy równanie Michaelis’a-Menten dla inhibicji substratem:

$r = \frac{\text{Vmax}*\text{Cs}}{\text{Km} + \text{Cs} + \frac{\text{Cs}^{2}}{K_{\text{is}}}}$ (f)

Km = 0, 6 ± 1, 9309 * 10⁻¹⁵

Vmax = 0, 15 ± 1, 4363 * 10⁻¹⁶

Kis = 50 ± 1, 8597 * 10⁻¹³

b. Metoda przemysłowa:

W tej metodzie wykorzystujemy całkową postać równania Michaelis’a-Menten dla inhibicji substratem:

$t = \frac{1}{\text{Vmax}}*\left( \text{Km}*\ln\left( \frac{\text{Cs}0}{\text{Cs}} \right) + \text{Cs}0 - \text{Cs} + \left( \frac{1}{2*\text{Kis}} \right)*\left( {\text{Cs}0}^{2} - \text{Cs}^{2} \right) \right)$ (g)

Km = 0, 97759 ± 0, 11228

Vmax = 0, 18918 ± 0, 00534

Kis = 24, 91453 ± 1, 44952

Cs	t mod	t eksp	t mod2
30	0,0	0	0
29,85	1,1	2,2	1,685676
29,7	2,1	4	3,368332
29,55	3,2	6	5,047966
29,25	5,3	11	8,398179
28,5	10,6	19	16,72093
27,75	15,9	26	24,9684
27,1	20,6	34	32,05544
26,3	26,2	42	40,70064
25,5	31,9	52	49,26075
24,1	41,9	66	64,03695
22,7	51,8	80	78,55479
21,3	61,8	97	92,81605
18,4	82,6	123	121,5508
15,4	104,1	150	150,1562
12,5	125,1	176	176,7702
8	158,2	211	216,258
4,3	186,4	239	247,6609
3,5	192,8	245	254,4946
2,2	203,8	256	265,9426
1,7	208,3	260	270,6084
1	215,3	267	277,7785
0,5	221,7	273	284,1476
0,2	227,5	278	290,0061

Tabela 4. Zależność czasu eksperymentalnego i modelowego oraz modelowego 2 od stężenia substratu.

Wykres 7.

Analizując Wykres 7. możemy stwierdzić, że czas modelowy (linia niebieska), wyznaczony w reaktorze okresowym, dla zwykłego modelu Michaelis’a- Menten nie pokrywa się z czasem eksperymentalnym, dlatego został wyznaczony drugi czas modelowy (zielone trójkąty), który bierze pod uwagę inhibicję substratem- wykresy się nakładają.

C. Reakcja z inhibicją produktem:

a) Obliczenie K_M i V_max z regresji liniowej:

Cs	r	1/Cs	1/r
0,1	0,021	10,000	46,667
0,2	0,038	5,000	26,667
0,3	0,050	3,333	20,000
0,5	0,068	2,000	14,667
0,8	0,083	1,333	12,000
1,0	0,094	1,000	10,667
1,5	0,107	0,667	9,333
2,0	0,115	0,500	8,667
2,5	0,121	0,400	8,267
3,0	0,125	0,333	8,000
4,0	0,130	0,250	7,667
5,0	0,134	0,200	7,467
7,5	0,139	0,133	7,200
10,0	0,142	0,100	7,067
15,0	0,144	0,067	6,933
20,0	0,146	0,050	6,867
30,0	0,147	0,033	6,800
40,0	0,148	0,025	6,767

Wykres 8.

Wykres 8.

Analizując Wykres 8. nie jesteśmy w stanie stwierdzić występowania inhibicji, gdyż jest on podobny do Wykresu 1. obrazującego podstawową kinetykę Michaelis’a- Menten.

Tak jak poprzednio dokonujemy linearyzacji Wykresu 8.

Wykres 9.

Korzystając z równania funkcji możemy obliczyć parametry kinetyczne: V_max i K_M:

Vmax	Km
0,15	0,60

$\frac{1}{\text{Vmax}} = 6,6667$, stąd:

Vmax = 0, 15

$\frac{\text{Km}}{\text{Vmax}} = 4$, stąd:

Km = 4 * Vmax = 4 * 0, 15 = 0, 60

b) Obliczenie parametrów kinetycznych: K_M i V_max z regresji nieliniowej:

1. Metoda biochemiczna

W tej metodzie posługujemy się równaniem Michaelis’a- Menten:

$$r = \frac{Vmax*Cs}{Km + Cs}$$

Km = 0, 6 ± 1, 6232 * 10⁻¹⁵

Vmax = 0, 15 ± 8, 4996 * 10⁻¹⁷

b. Metoda przemysłowa

Mając 3 niewiadome Km, Vmax i Ki program OriginPro 9.0 nie był w stanie prawidłowo ich wyliczyć, w związku z czym konieczne było podanie szacunkowych wartości Km i Vmax (wyliczonych metodą biochemiczną). Takim sposobem otrzymano wartość Ki.

W tej metodzie wykorzystujemy całkową postać równania Michaelis’a-Menten z inhibicją produktem:

$t = \frac{1}{\text{Vmax}}*\left\{ \text{Km}*\left( 1 + \frac{\text{Cs}0}{\text{Km}} \right)*\ln\left( \frac{\text{Cs}0}{\text{Cs}} \right) + \left( 1 - \left( \frac{\text{Km}}{\text{Ki}} \right) \right)*\left( \text{Cs}0 - \text{Cs} \right) \right\}$ (h)

Km = 0, 6

Vmax = 0, 15

Ki = 0, 34981 ± 0, 01948

Cs	tmod	teksp
30,00	0,0	0,0
29,85	1,0	1,0
29,70	2,0	2,0
29,55	3,1	3,1
29,25	5,1	5,1
28,50	10,2	10,4
27,75	15,3	15,8
27,10	19,7	20,5
26,30	25,2	26,4
25,50	30,7	32,5
24,10	40,2	43,6
22,70	49,8	55,1
21,30	59,4	67,2
18,40	79,3	94,6
15,40	100,0	127,0
12,50	120,2	164,0
8,00	152,0	240,2
4,30	179,1	342,0
2,00	197,5	463,7
0,70	210,4	627,5
0,20	218,7	821,3
0,10	222,1	928,2
0,05	225,3	1035,0

Tabela 6. Zależność czasu eksperymentalnego i modelowego od stężenia substratu.

Wykres 10.

Analizując Wykres 10. możemy zauważyć, że czas modelowy (niebieska linia), wyznaczony w reaktorze okresowym, znacząco różni się od czasu eksperymentalnego, co wskazuje na występowanie inhibicji. Aby sprawdzić jaki rodzaj hamowania występuje należy wyznaczyć czas modelowy 2 korzystając ze wzoru (h).

IV. Wnioski

Cel ćwiczenia, jakim było zapoznanie się z metodami wyznaczania parametrów kinetycznych dla reakcji katalizowanych enzymatycznie został zrealizowany. Przy pomocy arkusza kalkulacyjnego Excel korzystałyśmy z regresji liniowej i wykresu Lineweaver’a- Burk’a, pozwalającej prawidłowo opisać jedynie podstawowy model Michaelis’a- Menten, natomiast do reakcji bardziej skomplikowanych konieczne było wykorzystanie programu OriginPro 9.0 i metody regresji nieliniowej. Oba programy w sposób szybki i stosunkowo prosty pozwalają wyliczyć interesujące nas wielkości.

W związku z szerokim zastosowaniem enzymów jako naturalnych biokatalizatorów ich kinetykę można badać w dwojaki sposób: metodą biochemiczną lub przemysłową. Ta pierwsza daje dużo bardziej dokładne wyniki, pozwalające scharakteryzować nowo odkryte cząsteczki, natomiast przemysłowa stawia głównie na zysk i nie spełnia wszystkich wymaganych założeń. Porównując wyniki uzyskane tymi metodami możemy wnioskować, jak bardzo niedokładna jest metoda przemysłowa, jednak mimo wszystko błąd nadal mieści się w granicy błędu statystycznego. Aby z niej skorzystać, musimy wiedzieć, co chcemy osiągnąć oraz znać szacunkowe wartości podstawowych parametrów kinetycznych.

Jak wiemy, nie wszystkie enzymy działają zgodnie z modelem Michaelis’a- Menten, ponieważ mogą występować różne rodzaje hamowania, co powoduje dodatkowe utrudnienia w procesie poznawania enzymu. Aby sprawdzić czy mamy do czynienia z inhibicją konieczna jest weryfikacja w reaktorze okresowym. W tym celu wyznaczamy czas modelowy (z podstawowego równania Michaelis’a- Menten) i porównujemy go z uzyskanym czasem eksperymentalnym, a następnie otrzymane wartości nanosimy na wykres. Nałożenie się wykresów oznacza brak hamowania, natomiast różnica między nimi, występowanie inhibicji. Skąd wiadomo, jaki rodzaj hamowania nastąpił? Konieczne jest wyliczenie czasu modelowego 2 ze wzoru na inhibicję substratem- wzór (g) lub produktem- wzór (h) i ponowne wykonanie wykresu funkcji. Jeżeli krzywe się pokryją to wnioskujemy o danym rodzaju hamowania.

Podczas zajęć korzystałyśmy z odpowiednio dobranych wartości pomiarowych, które miały ułatwić nam zapoznanie się z procesem wyznaczania parametrów kinetycznych, jednak należy pamiętać, że w trakcie przeprowadzania eksperymentu w rzeczywistości, rzadko zdarza się otrzymanie tak wyidealizowanych wyników, dlatego znaczący wpływ na jakość badań ma dokładne wykonywanie pomiarów.

Literatura:

[1] Ciborowski J. Prof. Dr Inż., Podstawy inżynierii chemicznej, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 1965, s.723

[2] Notatki własne z wykładu, Inżynieria bioreaktorów, prowadzący Prof. Dr Hab. Inż. Andrzej Noworyta

[3] Ledakowicz S., Inżynieria biochemiczna, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2011, s.329-333

[4] Instrukcja do laboratorium z Biochemii , „Ćwiczenie A", Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Biochemii

[5] univ.gda.pl/instrukcja/biochemia_cw_4.pdf, 07.05.2014, godz. 15:08

[6] Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005, s.492,505,509

[7] Notatki własne z zajęć komputerowych, Laboratorium Inżynierii Bioreaktorów, prowadzący Dr Hab. Jolanta Bryjak, Prof. Nadzw., z dnia 30.04.2014