Wrocław, 13.05.14

Laboratorium

Inżynieria Bioreaktorów

Semestr letni 2013/2014

Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy(inwertaza).

28.04.2014r.

Grupa 4

Aleksandra Ruszkowska 193206

Natalia Lisowska 193398

I. Wstęp teoretyczny

Kinetyka enzymatyczna

Zapoznanie się z postępowaniem przy wyznaczaniu parametrów kinetycznych dla reakcji katalizowanych przez enzymy wymaga przede wszystkim znajomości podstawowego modelu opisującego ten proces. Mowa tu o kinetyce Michaelis’a-Menten działającej według poniższych założeń:

1. Założenie stanu stacjonarnego.

Kompleks ES powstaje z taką samą szybkością z jaką może wrócić do E+S lub przekształcić się do E+P, z czego wynika, że zmiana stężenia [ES] w czasie wynosi 0.

2. Powstawanie kompleksu ES jest reakcją odwracalną.

3. Założenie prędkości początkowej.

Enzym przyspiesza reakcję w obu kierunkach, wobec czego pomijamy możliwość odtworzenia z E+P kompleksu ES, gdyż szybkość takiej reakcji byłaby proporcjonalna do stężenia produktu, a jest ono na początku reakcji prawie równe zeru. Dla takiego założenia całkowitą ilość enzymu możemy policzyć jako sumę stężeń wolnego enzymu i kompleksu enzym-substrat [1].

Powyższe założenia możemy zobrazować jako [1]:

$E + S\begin{matrix} k_{1} \\ \rightleftarrows \\ k_{- 1} \\ \end{matrix}\ \text{ES}{\ E + P}$ (a)

gdzie:

E- enzym,

S- substrat,

P- produkt,

ES- kompleks enzym- substrat,

k₁- stała szybkości reakcji powstawania ES,

k_-1-stała szybkości reakcji rozpadu ES,

k₂-stała szybkości reakcji powstawania E+P.

Biorąc pod uwagę wyżej wymienione założenia oraz schemat reakcji (a), możemy skorzystać ze wzoru (równanie Michaelis’a-Menten)[1]:

$r = \frac{Vmax*Cs}{Km + Cs}$ (b)

gdzie:

r- szybkość reakcji ,

Vmax- maksymalna szybkość reakcji,

Km- stała Michaelis’a,

Cs- stężenie substratu.

Km i Vmax są to parametry kinetyczne równania. Stała Michaelis’a (Km) to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej (Vmax) [1]_.

Tą zależność doskonale ukazuje poniższy wykres:

Z wykresu 1. niestety nie jesteśmy w stanie odczytać parametrów kinetycznych, tj. K_M i Vmax, z powodu hiperbolicznego kształtu funkcji, dlatego trzeba zastosować linearyzację. Obecnie najczęściej stosowane linearyzacje to: Lineweaver’a-Burk’a , którą przedstawimy poniżej, a także Hanes’a-Woolf’a i Woolf’a-Augustinsson-Hofstee[2].

Wykres2. Linearyzacja równania Michaelis’a-Menten według Lineweaver’a- Burk’a

Autorstwo własne.

Przekształcając równanie Michaelis’a- Menten otrzymujemy zależność [1]:

$\frac{1}{r} = \frac{\text{Km}}{\text{Vmax}}*\frac{1}{\text{Cs}} + \frac{1}{\text{Vmax}}$ (c)

Wszelkie odstępstwa od liniowości świadczą o tym, że enzym nie działa zgodnie z modelem Michaelis’a- Menten i prawdopodobnie jest hamowany [1].

Rodzaje inhibicji:

• nieodwracalna- inhibitor łączy się kowalencyjnie z enzymem,

• odwracalna- następuje szybka dysocjacja kompleksu enzym-inhibitor:

• kompetycyjna,

• akompetycyjna,

• niekompetycyjna,

• mieszana- podobna do inhibicji niekompetycyjnej, ale występuje tu kompleks enzym-inhibitor-substrat [1].

Jeżeli reakcja hamowana jest przez produkt, to możemy mówić o szczególnym przypadku hamowania kompetycyjnego, gdyż jego powstawanie w trakcie trwania reakcji może działać na wolny enzym hamująco.

Podobnie drugi z reagentów- substrat, również może stać się inhibitorem. Jeżeli jest użyty w nadmiarze, wtedy mamy do czynienia ze szczególnym przypadkiem inhibicji niekompetycyjnej [3].

Inwertaza

W przeprowadzanym doświadczeniu kinetykę enzymatyczną badaliśmy na podstawie powszechnego w przemyśle enzymu- inwertazy.

Jest to enzym inaczej zwany też sacharazą lub β- fruktozydazą, katalizujący reakcję hydrolizy wiązania fruktofuranozydowego, co prowadzi do rozpadu sacharozy na glukozę i fruktozę. Proces ten nosi nazwę zjawiska inwersji, od którego pochodzi nazwa enzymu. Optimum działania obserwuje się w pH około 4.7, ponieważ zwiększenie go do około 10.0, spowodowałoby denaturację i całkowitą inaktywację inwertazy [4].

Znaczący wpływ na działanie tego biokatalizatora ma także temperatura, która powinna być niższa o około 5-10°C od temperatury optymalnej aby uniknąć częściowej denaturacji enzymu [5].

Inwertaza jest związkiem występującym w bakteriach oraz innych mikroorganizmach zarówno roślin wyższych, jak i zwierząt. U ludzi możemy ją znaleźć na powierzchni komórek nabłonka jelita cienkiego. Dla przemysłu niezwykle ważna jest jej zawartość w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, z których jest izolowana aby następnie wykorzystać ją do:

wyrobów cukierniczych, konfitur, marmolad i likierów. Służy także do wyrobu syropu cukru inwertowanego oraz zapobiega krystalizacji cukru w różnych produktach, do których jest dodawana. Istotną jej funkcją jest utrzymanie prawidłowego stanu wilgotności [6].

Cennym źródłem inwertazy jest ślina pszczół, ponieważ umożliwia im przemianę cukrów złożonych, znajdujących się w nektarze kwiatowym, do postaci cukrów prostych. Dzięki temu wytwarzany jest miód [7].

Reaktor okresowy (periodyczny)

Jest to reaktor, w którym przeprowadzamy reakcję w fazie ciekłej, a objętość nie ulega zmianie[8]. Substraty do reaktora dostarczone są jednorazowo, a wewnątrz następuje intensywne mieszanie. Po zakończeniu reakcji aparat jest opróżniany. Proces biegnie w warunkach nieustalonych, wobec czego jego kontrola jest bardzo trudna. Stężenie w reaktorze zmienia się w czasie i jest wyrównywane w całej objętości reaktora. Wraz z postępem reakcji ilość substratu zmniejsza się, co powoduje spadek szybkości reakcji. W reaktorze periodycznym występuje czas jałowy- czas bezproduktywny, w którym wykonywane są czynności dodatkowe, jak mycie reaktora. Sterylizacja jest bardzo pracochłonna, ale nie ma problemu z jej wykonaniem. Zaletą jest z pewnością duża szybkość reakcji, charakteryzująca tego typu reaktor, jak i duża przydatność mikrobiologiczna. Użyteczny jest nawet przy dużych, złożonych wymaganiach hodowli [9][10].

Reaktor okresowy jest bardzo często wykorzystywany w przemyśle, a to dlatego, że pozwala na uzyskiwanie wysokich stopni przemiany, ze względu na możliwość prowadzenia reakcji w dowolnie długim czasie. Podstawowe wady, które mogą zniechęcać do jego wykorzystania to wyższe koszty utrzymania, w porównaniu do reaktora przepływowego oraz pewne utrudnienia, które pojawiają się przy zwiększaniu zdolności produkcyjnej tego aparatu [11].

Wielkością charakteryzującą reaktory jest czas przebywania- czas, jaki dana substancja spędza w reaktorze, zależny od typu aparatu i rodzaju przepływu [9].

Aby wyznaczyć czas procesu w reaktorze periodycznym należy scałkować poniższe równanie [8]:

$\tau = \int_{C}^{C_{0}}\frac{\text{dC}}{r}$ (d)

W przeprowadzonym doświadczeniu reaktor okresowy mieszalnikowy posłużył nam do weryfikacji wyników uzyskanych w reaktorach mieszalnikowych.

II. Cel doświadczenia

Zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego dla reakcji katalizowanych enzymetycznie.

III. Metodyka

Przygotowanie roztworów.

Przygotowanie substratu: Do cylindra miarowego wprowadzono 50 ml 2 M roztworu sacharozy i dolano 50 ml 0,1 M buforu octanowego. Całość dobrze wymieszano. Następnie 50 ml świeżo przygotowanego roztworu wlano do kolejnego cylindra miarowego i uzupełniono buforem do 100 ml. Analogicznie przygotowano kolejne dwa roztwory (przez dwukrotne rozcieńczenie). Kolejne 4 roztwory przygotowano przez trzykrotne rozcieńczenie (15 ml roztworu sacharozy + 30 ml buforu).

Przygotowanie enzymu: Przygotowano 20 ml roztworu wyjściowego inwertazy o stężeniu 1 mg/ml w 0,1 M buforze octanowym. Roztwór dobrze zamieszano. Następnie przygotowano przez rozcieńczenie 2 roztwory enzymu:

I – do badań kinetycznych – 25x (2 ml E + 48 ml buforu);

II – do procesu w reaktorze okresowym – 4x (2,5 ml E + 7,5 ml buforu).

Oznaczenie stężenia glukozy testem enzymatycznym.

Do suchych, czystych i podpisanych probówek wprowadzono po 1 cm³ odczynnika do oznaczania glukozy. Przygotowano 4 probówki na standardy glukozowe i kontrolę. Z reaktorów zawierających badane roztwory oraz z próbki zawierającej standard pobrano po 10 μl roztworu i wprowadzono do odczynnika (z reaktorów 8 i 9 pobrano po 50 μl). Całość wstawiono na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37°C, a następnie zmierzono absorbancję, przy długości fali 500 nm, wobec próby kontrolnej zawierającej 1 ml odczynnika + 10 μl buforu octanowego.

Pomiar zmiany stężeń reagentów w początkowych etapach reakcji.

Przygotowano roztwory sacharozy o stężeniach:

Nr reaktora	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Csacharozy [M]	2,0	1,0	0,5	0,25	0,125	0,0417	0,0139	0,0046	0,0015

Do termostatowanych (35°C) reaktorów mieszalnikowych wprowadzono po 20 cm³ przygotowanych wcześniej roztworów, włączono mieszanie i zamknięto reaktory korkiem. Po 10-15 minutach preinkubacji do reaktorów wprowadzono kolejno dokładnie po 4 ml roztworu enzymu (I), włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sekundach pobrano z reaktora dokładnie 10 μl (lub 50 μl) mieszaniny reakcyjnej i dodano ją do probówki zawierającej 1 cm³ odczynnika. Probówkę zamieszano i wstawiono na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Kolejne próbki do analiz pobierano po 1, 2, 3, 4 i 5 minucie lub po 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów (1), (2) i (3)).

Pomiar zmiany stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy.

Do termostatowanego (35°C) reaktora mieszalnikowego wprowadzono 20 cm³ przygotowanego wcześniej roztworu substratu nr 5, włączono mieszanie i zamknięto reaktor korkiem. Po 10 - 15 minutach preinkubacji do reaktora wprowadzono 4 ml roztworu enzymu (II), włączając jednocześnie stoper. Po 10 – 15 sekundach pobrano z reaktora 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodano ją do probówki zawierającej 0,4 cm³ buforu octowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek). Probówkę zamieszano i następnie pobrano z niej 10 μl i postępowano dalej jak opisano powyżej. Kolejne próbki do analiz pobierano po 5, 10, 15, 20 min, a następne co 10 min. Uwzględniono 5-krotne rozcieńczenie próbki pobranej z reaktora.

Objaśnienie skrótów użytych do obliczeń:

A_śr,stand- uśredniona wartość absorbancji standardów glukozy

A₅₀₀ – absorbancja przy długości fali 500 nm

C_s,0 – stężenie początkowe substratu

C_stand. - stężenie standardu glukozy

C_s,0,rzecz – rzeczywiste początkowe stężenie substratu

C_s – stężenie substratu

C_p – stężenie produktu (glukozy)

C_E,pocz – początkowe stężenie enzymu równe 1 [mg/ml]

C_E,1 – stężenie enzymu w reaktorach mieszalnikowych

C_E,2- stężenie enzymu w reaktorze okresowym

R₁, R₂ – rozcieńczenia

α – stopień przereagowania

V_próbki – objętość pobranej próbki do badań z reaktora

V_s – objętość substratu

V_r – objętość roztworu (substratu + enzymu)

t_rzecz. – czas rzeczywisty reakcji

t_model. – czas modelowy reakcji

t_{model.inh.sub.} – czas modelowy reakcji inhibicji substratem

r – szybkość reakcji

K_m – stała Michaelis’a

V_max – szybkość maksymalna

V_max2- szybkość maksymalna dla reaktora okresowego

K_i – stała inhibicji substratem

k₃ – stała, liczba obrotów

IV. Wyniki dla reaktorów mieszalnikowych

UWAGA: czerwone pola w tabelach, to wartości, które nie zostały uwzględnione na wykresach.

Dla 9 reaktorów mieszalnikowych:

C_stand= 7,5[mM]

Reaktor I, C_s,0= 2000 [mM], V_próbki=10[µl], A_śr,stand=0,312

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,260	0,056
2	2,23	0,074
4	4,60	0,076
6	6,10	0,100
8	8,06	0,085
10	10,02	0,159

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
1667	1,35	1665	0,0808	0,261
	1,78	1665	0,107
	1,83	1665	0,110
	2,40	1665	0,144
	2,04	1665	0,123
	3,82	1663	0,229

Reaktor II, C_s,0= 1000[mM],[ V_próbki=10[µl], A_śr,stand=0,313

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
833	1,58	832	0,190	0,602
	2,25	831	0,270
	2,44	831	0,293
	5,01	828	0,601
	5,54	828	0,664
	7,31	826	0,877

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,350	0,066
2	2,13	0,094
4	4,01	0,102
6	6,04	0,209
8	8,09	0,231
10	10,06	0,305

Reaktor III, C_s,0= 500[mM], V_próbki=10[µl], A_śr,stand=0,311

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
417	0,748	416	0,179	0,726
	1,76	415	0,422
	3,69	413	0,885
	5,40	411	1,30
	6,54	410	1,57
	7,52	409	1,81

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,300	0,031
2	2,02	0,073
4	4,00	0,153
6	6,03	0,224
8	8,03	0,271
10	10,04	0,312

Reaktor IV, C_s,0= 250[mM], V_próbki=10[µl], A_śr,stand=0,294

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,293	0,051
1	1,03	0,061
2	2,02	0,091
3	3,17	0,106
4	4,02	0,160
5	5,02	0,205

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
208	1,30	207	0,624	0,817
	1,56	207	0,746
	2,32	206	1,11
	2,70	206	1,30
	4,08	204	1,96
	5,23	203	2,51

Reaktor V, C_s,0= 125[mM], V_próbki=10[µl], A_śr,stand=0,310

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,387	0,024
1	1,01	0,054
2	2,01	0,086
3	3,02	0,121
4	4,01	0,153
5	5,08	0,187

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
104	0,581	104	0,557	0,826
	1,31	103	1,25
	2,08	102	2,00
	2,93	101	2,81
	3,70	100	3,55
	4,52	99,6	4,34

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,273	0,024
1	1,01	0,054
2	2,00	0,086
3	3,05	0,121
4	4,00	0,153
5	5,02	0,187

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
34,8	0,570	34,2	1,64	0,806
	1,28	33,5	3,69
	2,04	32,7	5,87
	2,87	31,9	8,26
	3,63	31,1	10,4
	4,44	30,3	12,8

Reaktor VII, C_s,0= 13,9[mM], V_próbki=10[µl], A_śr,stand=0,307

t [min]	trzecz . [min]	A500
0,25	0,358	0,006
1	1,04	0,013
2	1,56	0,022
3	2,59	0,035
4	4,01	0,046
5	5,00	0,059

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
11,6	0,146	11,4	1,27	0,274
	0,317	11,3	2,74
	0,537	11,0	4,64
	0,855	10,7	7,38
	1,12	10,5	9,70
	1,44	10,1	12,4

Reaktor VIII, C_s,0= 4,6[mM], V_próbki=50[µl], A_śr,stand=0,306

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
3,83	0,0357	3,78	0,931	0,143
	0,112	3,72	2,92
	0,280	3,55	7,31
	0,372	3,46	9,70
	0,505	3,33	13,2
	0,662	3,17	17,3

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,433	0,007
1	1,03	0,022
2	2,02	0,055
3	3,00	0,073
4	4,01	0,099
5	4,59	0,130

Reaktor IX, C_s,0= 1,5[mM], V_próbki=50[µl], A_śr,stand=0,303

t [min]	trzecz [min]	A500
0,25	0,293	0,008
1	1,01	0,009
2	2,02	0,031
3	3,02	0,023
4	4,01	0,033
5	4,58	0,037

Cs,0,rzecz [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]	r [mM/min]
1,25	0,0411	1,21	3,29	0,0364
	0,0463	1,20	3,70
	0,159	1,09	12,7
	0,118	1,13	9,46
	0,170	1,08	13,6
	0,190	1,06	15,2

V. Przykładowe obliczenia dla reaktora VIII

• Obliczenie początkowego, rzeczywistego stężenia substratu:

$$C_{s,0,rzecz} = C_{s,0} \bullet \frac{V_{s}}{V_{r}} = 4,6 \bullet \frac{20}{24} = 3,83\ \lbrack mM\rbrack$$

• Obliczenie stężenia produktu:

$$C_{p} = \frac{A \bullet C_{\text{stand.}}}{Asr,stand}*\frac{1}{5}*\frac{1050}{1010} = \frac{0,007 \bullet 7,5}{0,306}*0,2*\frac{1050}{1010} = 0,0357\ \lbrack mM\rbrack$$

W tym reaktorze i reaktorze IX zostało uwzględnione rozcieńczenie. Dla pozostałych 7 reaktorów wzór na C_p ograniczony był jedynie do pierwszej części.

• Obliczenie stężenia substratu:

C_s = C_{s, 0, rzecz} − C_p = 3, 83 − 0, 0357 = 3, 78 [mM]

• Obliczenie stopnia przereagowania:

$$\alpha = \frac{C_{p}}{C_{s,0,rzecz}} \bullet 100\% = \frac{0,0357}{3,83} \bullet 100\% = 3,29\lbrack\%\rbrack$$

VI. Wykresy dla reaktorów mieszalnikowych

Wyznaczenie szybkości reakcji na podstawie wykresów C_p=f(t) dla każdego z reaktorów. Dla reaktora VIII równanie ma postać y=0,1425-0,0303, a ponieważ współczynnik a=r, to r=0,143[ $\frac{\text{mM}}{\min}$]

VII. Wyznaczenie równania Michaelis’a-Menten i parametrów kinetycznych

Nr reaktora	Cs,0,rzecz [mM]	r [mM/min]	1/Cs[1/mM]	1/r [min/mM]
I	1667	0,261	0,000600	3,84
II	833	0,602	0,00120	1,66
III	417	0,726	0,00240	1,38
IV	208	0,817	0,00480	1,22
V	104	0,826	0,00960	1,21
VI	34,8	0,806	0,0288	1,24
VII	11,6	0,274	0,0863	3,64
VIII	3,83	0,143	0,261	7,02
IX	1,25	0,0364	0,800	27,5

Na podstawie powyższej tabeli sporządzono wykres Michaelis’a-Menten oraz dwa wykresy podwójnych odwrotności Lineweaver’a-Burk’a. Dwa, ponieważ dopiero po odrzuceniu zbyt odstających punktów jest on bardziej poprawny.

Powyższy wykres nie jest typowym odzwierciedleniem modelu Michaelis’a- Menten, ponieważ widzimy wyraźny spadek szybkości reakcji po osiągnięciu przez nią maksimum, wobec czego możemy się spodziewać występowania inhibicji.

Z wykresu Michaelis’a-Menten niestety nie jesteśmy w stanie odczytać parametrów kinetycznych, tj. K_M i Vmax, z powodu nieodpowiedniego kształtu funkcji, dlatego trzeba zastosować linearyzację Lineweaver’a- Burk’a.

Z drugiego wykresu Lineweaver’a-Burk’a mogłyśmy obliczyć szacunkowe wartości Km i Vmax:

$$\frac{1}{V_{\max}} = 0,7571\ \ \ = > \ \ \ V_{\max} = 1,32\ \left\lbrack \frac{\text{mM}}{\min} \right\rbrack$$

$$\frac{K_{m}}{V_{\max}} = 32,49\ \ \ = > \ \ \ K_{m} = 42,9\ \lbrack mM\rbrack$$

Dzięki wartościom wyliczonym na podstawie regresji liniowej mogłyśmy obliczyć wszystkie parametry z regresji nieliniowej.

Z programu OriginPro 9.0 zostały wyznaczone parametry kinetyczne:

	Value	Standard Error
Vmax	1,17	0,18077
Km	24,35	9,53402
Ki	804,91	380,10679

• Obliczenia k₃ oraz V_{max 2}:

V_max = C_E, 1 • k₃

$$C_{E,1} = \frac{C_{E,pocz}}{R_{1}} = \frac{1}{25} = 0,0400\ \lbrack mM\rbrack$$

$$\text{\ \ \ \ \ }k_{3} = \frac{V_{\max}}{C_{E,1}} = \frac{1,17}{0,04} = 29,6\left\lbrack \frac{1}{\min} \right\rbrack$$

$$C_{E,2} = \frac{C_{E,pocz}}{R_{2}} = \frac{1}{4} = 0,250\ \left\lbrack \text{mM} \right\rbrack$$

$$V_{max2} = k_{3} \bullet C_{E,2} = 29,25 \bullet 0,250 = 7,31\left\lbrack \frac{\text{mM}}{\min} \right\rbrack$$

trzecz [min]	A500	Cs,0,rzecz[mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]
0,58	0,0280	104	3,47	101	3,33
1,11	0,0650		8,05	96,1	7,73
2,01	0,115		14,2	89,9	13,7
3,01	0,131		16,2	87,9	15,6
4,01	0,220		27,3	76,9	26,2
5,02	0,283		35,1	69,1	33,7
6,05	0,299		37,0	67,1	35,6
8,01	0,305		37,8	66,3	36,3
10	0,292		36,2	68,0	34,7
15	0,302		37,4	66,8	35,9
21,45	0,265		32,8	71,3	31,5
24,59	0,269		33,3	70,8	32,0
30,01	0,258		32,0	72,2	30,7
35,09	0,259		32,1	72,1	30,8
39,59	0,262		32,5	71,7	31,2
45,17	0,259		32,1	72,1	30,8
50,34	0,262		32,5	71,7	31,2
55,02	0,259		32,1	72,1	30,8
60,02	0,252		31,2	72,9	30,0
70,31	0,248		30,7	73,4	29,5
79,58	0,252		31,2	72,9	30,0
90	0,251		31,1	73,1	29,9
100,01	0,263		32,6	71,6	31,3

VIII. Wyniki dla reaktora okresowego

V_max2=7,31[mM/min]

Km=24,4[mM]

Ki=805[mM]

Cs,0,rzecz[mM]	Cp[mM]	Cs[mM]	α[%]	tmodel.[min]	tmodel.inh.sub [min]	trzecz [min]
37,8	3,45	34,3	9,18	8,31	0,812	0,580
	8,05	29,7	21,3	6,18	1,94	1,11
	14,2	23,5	37,7	5,15	3,58	2,01
	16,2	21,5	43,0	4,99	4,15	3,01
	27,3	10,5	72,2	4,80	8,04	4,01
	35,1	2,71	92,8	5,04	13,6	5,02
	37,0	0,734	98,1	5,13	18,1	6,05

IX. Przykładowe obliczenia dla reaktora okresowego

• C_s,0, C_p, C_s, i α zostały obliczone analogicznie jak przy reaktorach mieszalnikowych, z uwzględnieniem pięciokrotnego rozcieńczenia C_p.

• Obliczenie czasu modelowego:

$t_{\text{model}} = \left( \frac{1}{\text{Vmax}2} \right)*\left( \text{Km}*\ln\left( \frac{Cs,0,rzecz}{\text{Cs}} \right) + Cs,0,rzecz - \text{Cs} \right) = \left( \frac{1}{7,31} \right)*\left( 24,4*ln\left( \frac{37,8}{34,3} \right) + 37,8 - 34,3 \right)$=8,31[min]

• Obliczenie czasu modelowego z inhibicją substratem:

$t_{\text{model.inh.sub}} = \frac{1}{\text{Vmax}2}*\left( \text{Km}*\ln\left( \frac{\text{Cs},0,\text{rzecz}}{\text{Cs}} \right) + \text{Cs},0,\text{rzecz} - \text{Cs} + \left( \frac{1}{2*\text{Ki}} \right)*\left( {\text{Cs},0,\text{rzecz}}^{2} - \text{Cs}^{2} \right) \right) = \left( \frac{1}{7,31} \right)*\left( 24,4*ln\left( \frac{37,8}{34,3} \right) + 37,8 - 34,3 + \left( \frac{1}{2*805} \right)*\left( {37,8}^{2} - {34,3}^{2} \right) \right) = 0,812\lbrack min\rbrack$

X. Wykresy dla reaktora okresowego

Analizując powyższe wykresy jednoznacznie możemy stwierdzić, że w przeprowadzanym na reaktorze okresowym doświadczeniu występuje inhibicja, jednak nasz czas eksperymentalny nie pokrywa się idealnie z czasem modelowym (niebieska linia ciągła).

XI. Wnioski

Przeprowadzając doświadczenie potwierdziliśmy właściwości katalityczne użytego w nim enzymu inwertazy oraz uzyskaliśmy wartości konieczne do wyznaczenia parametrów kinetycznych reakcji. Przedstawiony w wynikach wykres Michelis’a-Menten podsumowujący pracę dziewięciu reaktorów mieszalnikowych pozwala wnioskować o występowaniu inhibicji substratowej, ponieważ obserwujemy znaczący spadek szybkości reakcji, w momencie osiągnięcia Vmax, mimo iż stężenie substratu rosło. Z wykresu Michaelis’a-Menten niestety nie byłyśmy w stanie odczytać parametrów kinetycznych, tj. K_M i Vmax, z powodu nieodpowiedniego kształtu funkcji, dlatego zastosowałyśmy linearyzację Lineweaver’a- Burk’a. Na tej podstawie mogłyśmy określić szacunkowe wartości parametrów kinetycznych aby następnie skorzystać z programu OriginPro 9.0.

OriginPro 9.0 to prosty w obsłudze program, który pozwolił nam za pomocą regresji nieliniowej otrzymać wartości Km, Vmax i Ki. Obarczone są one dużym błędem, gdyż konieczne było odrzucenie punktów całkowicie odbiegających od pozostałych (czerwone zaznaczenie).

Mówiąc o błędach należy wspomnieć o tym, że enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy, która została przez nas wykonana, jest mikrometodą, czyli wymaga bardzo dokładnego przeprowadzenia. Zabrudzone szkło i nieodpowiednie pipetowanie mogły być przyczyną kłopotów w wyznaczaniu stałych kinetycznych [12].

Uzyskane w reaktorach mieszalnikowych wyniki poddano weryfikacji w reaktorze okresowym, jednak podczas wykonywania doświadczenia popełniono błąd (błędy), który spowodował(y), że nie uzyskaliśmy wysokiego stopnia przereagowania, a jedynie około 36%.

Pomyłka mogła zajść z wielu powodów, zaczynając już od złego przygotowania enzymu- niedokładne rozcieńczenie próbki, substratu lub nieprzestrzegania czasu pobierania próbek z reaktora. Aby zobrazować przebieg doświadczenia musiałyśmy przyjąć, że 100% przereagowania następowało dla próbki o najwyższej zmierzonej absorbancji sięgającej 0,305, która w rzeczywistości odpowiadała stopniowi przereagowania α=36,3[%].

Pracę reaktora okresowego obrazują wykresy w punkcie X. sprawozdania. Możemy zauważyć, że dla czasu modelowego wyliczonego ze wzoru przy braku inhibicji, uzyskane wyniki znacząco się różnią, a wykresy biegną w całkowicie odmiennych kierunkach. Na tej podstawie wnioskujemy o występowaniu hamowania. Aby to potwierdzić należy skorzystać z całkowej postaci wzoru dla czasu modelowego z inhibicją substratem. Wykres zależności t_{model.inh.sub} i t_rzecz=f(Cs) pozwala nam potwierdzić wcześniejsze przypuszczenia, gdyż w pewnych przedziałach czas modelowy pokrywa się z czasem eksperymentalnym.

Literatura:

[1] Instrukcja do laboratorium z Biochemii I , „Ćwiczenie A-Kinetyka enzymatyczna I", Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Biochemii, Wrocław 2011.

[2] Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005, s.492,505,509

[3] Klimiuk E., Lossow K., Bulińska M., Kinetyka reakcji i modelowanie reaktorów biochemicznych w procesach oczyszczania ścieków, Wydawnictwo ART, Olsztyn 1995,

s. 48-49.

[4]http://laboratoria.net/pl/artykul/Inwertaza%20%E2%80%93%20enzym%20pozyskiwany%20z%20kom%C3%B3rek%20dro%C5%BCd%C5%BCowych%3A%20wybrane%20metody%20izolacji,oznaczania%20i%20oczyszczania;19764.html, Autor: Lidia Koperwas, data i godzina pobrania: 12.05.2014r., 20:17.

[5] Notatki własne z zajęć komputerowych, Laboratorium Inżynierii Bioreaktorów, prowadzący Dr Hab. Jolanta Bryjak, Prof. Nadzw., z dnia 30.04.2014r.

[6] http://www.ciam.pl/skladnik-e1103, brak autora tekstu, data i godzina pobrania: 12.05.2014r., 20:39.

[7] http://www.chem.uw.edu.pl/people/AMyslinski/Litwin/ins_29_30.pdf, Myśliński A., Litwinienko G., data i godzina pobrania: 12.05.2014, 20:53.

[8] Ciborowski J. Prof. Dr Inż., Podstawy inżynierii chemicznej, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 1965, s.723-725

[9] Notatki własne z wykładu, Inżynieria bioreaktorów, prowadzący Prof. Dr Hab. Inż. Andrzej Noworyta

[10] Ledakowicz S., Inżynieria biochemiczna, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2011, s.329-333

[11] Tabiś B., Zasady inżynierii reaktorów chemicznych, Wydawnictwo Naukowo- Techniczne, Warszawa 2000, s. 89.

[12] Instrukcja do laboratorium z Inżynierii Bioreaktorów 2013/2014 sem. Letni, Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy (inwertaza),

Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska