14.04.2014r.

Laboratorium Inżynieria bioreaktorów

Sprawozdanie

INWERTAZA

Patrycja Janczak 193465

Judyta Raniś 193286

1. Wstęp teoretyczny:

Kilka słów o inwertazie:

Inwertaza (sacharaza, β-fruktofuranozydaza), jest enzymem należącym do grupy hydrolaz glikozydowych która po raz pierwszy wyizolowana została z ekstraktu drożdżowego w roku 1860 przez znanego francuskiego polityka i chemika - Berthelot'a. Inwertazy katalizują nieodwracalną reakcję hydrolizy dwucukru sacharozy do glukozy i fruktozy oraz trójcukru rafinozy do fruktozy i melibiozy, poprzez rozerwanie wiązań glikozydowych powstałych z udziałem grupy hydroksylowej w położeniu β. [1][4]

Dodatkowo inwertazy charakteryzują się stosunkowo wysoką aktywnością w szerokim przedziale pH (3,5-5,5), co odróżnia je od większości innych enzymów. Aktywność większości izoenzymów osiąga optimum przy 55˚C, natomiast wartość stałej Michaelisa - Menten zmienia się w szerokim zakresie, ale dla większości enzymów mieści sie w granicach od 2 mM do 5 mM. Wartość tej stałej ulega jednocześnie gwałtownej zmianie w momencie gdy mamy do czynienia z wolnym enzymem - wówczas wzrasta ona do około 30 mM. Inwertaza charakteryzuje się również szerokim występowaniem, od bakterii i mikroorganizmów, przez rośliny wyższe, aż do zwierząt, w tym człowieka.[2][4]

Ze względu na lokalizację komórkową, optimum pH, rozpuszczalność oraz punkt izoelektryczny inwertazy występujące u roślin wyższych podzielono na trzy podgrupy:

• inwertazy wakuolarne - jak sama nazwa wskazuje występują w wakuoli, charakteryzują się dużą rozpuszczalnością oraz pH optymalnym wypadającym w kwaśnym przedziale skali (5,0-5,5),

• inwertazy związane ze ścianą komórkową - występujące w ścianie komórkowej i związane z nią za pomocą oddziaływań jonowych, nierozpuszczalne, ich optymalne pH przypada na wartość 3,5 - 5,0,

• inwertazy neutralne - występują w cytoplazmie, podobnie jak inwertazy wakuolarne charakteryzuje je duża rozpuszczalność, jednak optymalna wartość pH wypada na przedział 6,8 - 8,0. [3][5]

To właśnie u roślin wyższych obserwujemy największą różnorodność inwertaz. U człowieka enzymy te występują na wewnętrznej powierzchni jelita cienkiego i pełnią istotne funkcje związane z trawieniem oraz wchłanianiem produktów hydrolizy sacharozy. [1][3]

Inwertazy znalazły zastosowanie przede wszystkim w przemyśle spożywczym, ukrywając się pod symbolem E1103. Enzym może być bowiem stosowany w produkcji cukierniczej, do przygotowania syropu cukru inwertowanego, który z kolei stanowi dodatek do miodu, konfitur, likierów, czekoladek itp. Zastosowanie inwertazy w tej branży wynika przede wszystkim ze smaku fruktozy - jest znacznie słodsza niż sacharoza, a dodatkowo nie krystalizuje tak łatwo, co obecnie stanowi główny problem związany z użytkiem sacharozy. Jednocześnie nie obserwuje się gwałtownego wzrostu zainteresowania inwertazą z powodu innego konkurencyjnego enzymu - izomerazy glukozowej, która pozwala otrzymać fruktozę z glukozy w znacznie tańszy i bardziej ekonomiczny sposób. Ponadto ze względów zdrowotnych oraz smakowych wymagany jest wysoki stopień oczyszczenia inwertazy przed jej użyciem. [1][2][4]

Obecne inwertazy izolowane są głownie z rekombinowanych szczepów drożdży Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces carlsbergensis. Wykorzystanie do tego celu drożdży wynika przede wszystkich z niewielkich kosztów ich nabycia oraz łatwej dostępności. Ponadto enzymy wyizolowane ze wspomnianych szczepów charakteryzują się wysoką stabilnością enzymu. [2][4][6]

Kilka słów o reaktorach okresowych:

Reaktor chemiczny jest to, w najprostszym ujęciu, naczynie przystosowane do przeprowadzania w nim określonej reakcji chemicznej. W skali przemysłowej, konstrukcja reaktora i parametry zachodzącego w nim procesu powinny zapewniać uzyskanie optymalnych wyników ekonomicznych. Reaktory chemiczne i procesy w nich zachodzące stanowią zazwyczaj zasadniczy element ciągu technologicznego mającego na celu wytworzenie określonego produktu chemicznego. To właśnie od prawidłowej pracy reaktora chemicznego zależą zazwycza wyniki produkcyjne i ekonomiczne. [8][9]

W praktyce przemysłowej i laboratoryjnej znanych jest bardzo wiele typów reaktorów chemicznych. Ich zróżnicowanie oraz bogactwo jest przede wszystkim wynikiem zróżnicowanych potrzeb oraz różnorodności procesów chemicznych. Biorąc pod uwagę organizację procesu w czasie, a jednocześnie sposób zasilania aparatu, reaktory chemiczne możemy podzielić na [7]:

• reaktory okresowe,

• reaktory półokresowe i półprzepływowe,

• reaktory przepływowe.

Nazwa reaktora okresowego nawiązuje do sposobu jego pracy. Podczas pracy tego typu reaktora substraty są jednorazowo, w całości doprowadzane, intensywnie mieszane dla zapewnienia homogeniczności mieszaniny, a po zakończeniu reakcji aparat jest opróżniany. W aparatach tego rodzaju procesy chemicznie mogą być prowadzone wyłącznie w warunkach nieustalonych, co jest charakterystyczną cechy reaktorów okresowych oraz półokresowych. [7][9]

Reaktory okresowe najczęściej są stosowane do prowadzenia procesów z udziałem reagentów ciekłych. Prowadzi się w nich zarówno procesy laboratoryjne, a więc w małej skali, do testowania nowo opracowanych technologii, jak również do procesów w pełnej skali przemysłowej. Hodowle okresowe, przeprowadzane w reaktorach okresowych są powszechnie stosowane w biotechnologiach do: namnażania biomasy mikroorganizmów oraz produkcji pierwotnych i wtórnych produktów metabolizmu. Zaletą reaktorów okresowych jest możliwość uzyskiwania wysokich stopni przemiany ze względu na dowolnie długi czas reakcji. Niestety posiada on także swoje wady. Ze względu na większy koszt operacyjny w porównaniu z aparatami przepływowymi oraz pewne utrudnienia pojawiające się przy zwiększaniu zdolności produkcyjnej instalacji, podjęcie decyzji o wyborze reaktora nie musi być łatwą decyzją. W przypadki wspomnianych hodowli okresowych główne ograniczenia wynikają z braku możliwości kontrolowania stężenia substratu i dotyczą procesów, w których mikroorganizmy są wrażliwe na wysokie stężenia substratu. [7][12]

Najprostszy typ reaktora periodycznego (okresowego) zbudowany jest jedynie ze zbiornika z otworami znajdującymi się w górnej i dolnej części. Typowy reaktor wsadowy zawiera dodatkowo mieszadło, zintegrowany system ogrzewania/chłodzenia, a także wężownicę lub płaszcz, który może być stosowany do regulacji temperatury. Ciecze i ciała stałe są na ogół doprowadzane za pośrednictwem połączeń w górnej pokrywie reaktora. Płyny natomiast zwykle odprowadza sie z dołu. Ponadto na reaktorach okresowych instaluje się urządzenia do pomiaru istotnych wielkości z punktu widzenia procesowego. [7][10][11]

Do przeprowadzenia jakiekolwiek procesu w reaktorze niezbędne jest przeprowadzenie odpowiednich obliczeń. Należy znać ilości każdego składnika, jakie są potrzebne do wytworzenia pożądanej ilości produktów. Obliczenia te oparte są na schemacie reakcji chemicznej lub mikrobiologicznych wzorach wzrostu. Podobne obliczenia pozwalają użytkownikowi określić także czas trwania reakcji. Ze względu na obecność pracującego mieszadła, przyjmuje się w obliczeniach inżynierskich założenie o całkowitym wyrównaniu stężeń i temperatury w całej objętości reakcyjnej. Oznacza to, iż objętością podlegającą bilansowaniu jest cała objętość mieszaniny reakcyjnej w aparacie. Zaprojektowanie reaktora okresowego polega także na określeniu czasu potrzebnego do uzyskania żądanego stopnia przemiany reagentów. [7][10]

Do zalet wynikających ze stosowania reaktorów okresowych zaliczymy prostotę prowadzenia operacji, możliwość utrzymania skomplikowanych hodowli mikroorganizmów, łatwość utrzymania warunków jałowych, odnawialność substratów (w przypadku odnawialności inokulum zapobiega to degeneracji szczepu), a przede wszystkim krótszy czas reakcji w porównaniu z reaktorem ciągłym. Ponadto opisywany typ reaktora charakteryzuje się również dużą elastycznością produkcji. Jest wyjątkowo przydatny, gdy naszym celem jest wytworzenie stosunkowo niewielkich ilości produktu w tym samym czasie. Zupełnie nie sprawdza sie, gdy chcemy produkować określony związek "raz po raz", ze względu na konieczność opróżniania oraz czyszczenia przed każdym kolejnym cyklem produkcyjnym. Tak więc podstawową wadą stosowania reaktorów okresowych jest ich niska produktywność, a także brak możliwości regulacji stężenia substratu. [9][12][13]

Do podstawowych problemów związanych z użytkowanie reaktorów okresowych należy utrzymanie odpowiedniej temperatury. Regulacja temperatury reaktora i utrzymywanie jej na odpowiednim poziome jest zazwyczaj niezwykle istotne dla jakości produktu, szybkości, a także kosztów produkcji. Obliczenia inżynierskie dotyczące reaktorów okresowych często zakładają model procesów izotermicznych. Reakcjom chemicznym towarzyszą jednak znaczne efekty energetyczne i nie zawsze udaje się tak sprawnie zorganizować wymianę ciepła z otoczeniem, aby zapewnić warunek izotermiczności. Ogólnie rzecz ujmując, odstępstwa od izotermiczności będą narastały w miarę:

• zwiększania efektów energetycznych reakcji,

• zwiększania stężenia reagentów oraz szybkości reakcji,

• zmniejszenia pojemności cieplnej środowiska,

• zmniejszania intensywności wymiany ciepła z otoczeniem. [7][14]

Procesy biochemiczne przebiegają jednak stosunkowo wolno. Jeżeli prowadzi się je w reaktorach zbiornikowych czy rurowych to w większości przypadków można zapewnić ich praktyczną izotermiczność. Natomiast dla szybszych reakcji chemicznych, wiążącymi się znacznymi efektami cieplnymi bardziej odpowiednie będzie zastosowanie modeli nieizotermicznych. Ponadto wciąż trwają prace nad ulepszeniem płaszczy termoizolacyjnych oraz kontroli temperatury reaktorów. Stosunkowo niedawno pojawiły się nowe systemy ogrzewania i chłodzenia reaktorów, które charakteryzują się szybkim nagrzewaniem/ochładzaniem do nowego punktu nastawy bez wahań i z minimalnym przekroczeniem ustawionej temperatury, a także trwałą odpowiedzią na zakłócenia wynikające z przeprowadzanych reakcji. [7][14]

2. Cel ćwiczenia:

Zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego.

3. Materiały i metody:

• Materiały:

- inwertaza otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;

- 2 M roztwór sacharozy;

- 0.1 M bufor octanowy, pH 4.5;

- odczynnik do oznaczania stężenia glukozy – odczynnik I

• Aparatura specjalna

- spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;

- termostatowane reaktory mieszalnikowe

• Metody

Przygotowanie roztworów

Substrat. Do cylindra miarowego na 100 ml wprowadzono 50 ml 2M sacharozy (roztwór 1), dodano 50 ml 0.1 M buforu octanowego i wymieszano (roztwór 2). Następnie 50 ml świeżo przygotowanego roztworu wlano do kolejnego cylindra miarowego i uzupełniono buforem do 100 ml (roztwór 3). Analogicznie przygotowano roztwory 4 i 5 przez 2-krotne rozcieńczenie roztworu poprzedzającego. Kolejne 4 roztwory przygotowano przez 3-krotne rozcieńczenia (15 ml roztworu sacharozy + 30 ml buforu). Dokładnie wymieszano roztwory.

Enzym. Przygotowano 20 ml roztworu wyjściowego inwertazy o stężeniu 1 mg/ml w 0.1 M buforze octanowym. Wymieszano. Przygotowano przez rozcieńczenie 2 roztwory enzymu:

I – do badań kinetycznych – 25x (2 ml E + 48 ml buforu);

II – do procesu w reaktorze okresowym – 4x (2,5 ml E + 7,5 ml buforu).

Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.

Odczynniki: Odczynnik I (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP, HBA, bufor fosforanowy), stabilizowany standard glukozy 15 mM.

Oznaczanie stężenia glukozy. Do suchych i czystych probówek wprowadzono po 1 cm3 odczynnika do oznaczania glukozy. Przygotowano również 4 probówki na standardy glukozowe i kontrolę (próbkę do zerowania aparatu). Z reaktorów pobierano próbki po 10 ul (lub 50 ul w przypadku reaktora 8 i 9) i dozowano je bezpośrednio do probówek zawierających odczynnik I. Analogicznie postąpiono ze standardami i kontrolą (próbka do zerowania aparatu). Każdorazowo kilkakrotnie przepłukano końcówkę odczynnikiem I. Probówki pozostawiono przez 5 min w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni, a następnie zmierzono absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej (1 ml odczynnika I + 10 ul 0,1 M buforu octowego pH 4,5).

Obliczanie stężenia glukozy. Wartości absorbancji dla 3 standardów glukozy uśredniono i przyjęto, że Cśr = 7,5 mM. Z proporcji obliczono stężenie w próbkach badanych, a otrzymane wartości pomnożono przez (ewentualne) rozcieńczenie. W efekcie otrzymano stężenie glukozy w mM roztworu reakcyjnego.

Pomiar zmiany stężeń reagentów w początkowych etapach reakcji.

Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach:

1	2	3	4	5	6	7	8	9
2,0	1,0	0,5	0,25	0,125	0,0417	0,0139	0,0046	0,0015

Do termostatowanych (35^oC) reaktorów mieszalnikowych wprowadzono po 20 cm3 przygotowanych roztworów, włączono mieszanie i zamknięto korkiem. Po 10-15 min preinkubacji do reaktorów wprowadzono kolejno dokładnie po 4 ml roztworu enzymu (I), włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrano z reaktora dokładnie 10 ul (lub 50 ul) mieszaniny reakcyjnej i dodano do probówki zawierającej 1 cm3 odczynnika I. Probówkę zamieszano i wstawiono na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni. Kolejne próbki do analiz pobierać po 1, 2, 3, 4 i 5 minucie lub po 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów (1), (2) i (3)).

Pomiar zmiany stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy

Do termostatowanego (35^oC) reaktora mieszalnikowego wprowadzono 20 cm3 przygotowanego roztworu substratu nr 5, włączono mieszanie i zamknięto korkiem. Po 10-15 min preinkubacji do reaktora wprowadzono 4 ml roztworu enzymu (II), włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrano z reaktora 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodano do probówki zawierającej 0,4 cm3 0,1 M buforu octowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek). Probówkę zamieszano i pobrano z niej 10 ul i postępowano jak opisano wcześniej. Kolejne próbki do analiz pobierano po 5, 10, 15, 20 min, a następne co 10 min. Uwzględniono 5-krotne rozcieńczenie próbki pobranej z reaktora.

4. Wyniki oraz obliczenia

Oznaczenia:

• A_st.sr.  - absorbancja średnia standardu,

• A_sr.s. - absorbancja średnia substratu,

• R - rozcieńczenie,

• x - początkowe stężenie glukozy nie uwzględniające rozcieńczenia,

• Cs_rz, 0 - rzeczywiste stężenie początkowe,

• A_sr. - absorbancja średnia próbki,

• x - stężenie glukozy w próbce nie uwzględniające rozcieńczenia.,

• C_s - stężenie substratu,

• t - czas,

• V_R - objętość robocza reaktora,

• α - obliczenie stopnia przereagowania,

• r - szybkość reakcji,

• C_p - stężenie produktu,

• tm−czas modelowy,

• liczby oznaczone kolorem czerwonym zostaly odrzucone ze wzgledu na duza rozbieznosc 

w stosunku do pozostalych wynikow.

• Dane:

C_stand. – 15 [mM]

V_próbki – 10 [µl]

V_próbki – 50 [µl] dla reaktorów 8 & 9

Reaktor 1
Cs,rz,0
[mM]
1666,667
Reaktor 2
833,333
Reaktor 3
416,667
Reaktor 4
208,333
Reaktor 5
104,167
Reaktor 6
34,750
Reaktor 7
11,583
"-" - na wskutek drobnej awarii nasze koleżanki nie mogły wykonać pomiaru w odpowiednim czasie.
Reaktor 8
3,833
Reaktor 9
1,250

Przykładowe obliczenia dla reaktora 5:

Obliczenie stężenia produktu:

$$C_{p} = \frac{A \bullet C_{\text{stand.}}}{As,sr} = \frac{0,016 \bullet 15}{0,604} = 0,397\ \lbrack mM\rbrack$$

Obliczenie rzeczywistego, początkowego stężenia substratu:

$$C_{s,rz,0} = C_{s,t} \bullet \frac{V_{s}}{V_{r}} = 125 \bullet \frac{20}{24} = 104,167\ \lbrack mM\rbrack$$

Obliczenie stężenia substratu:

C_s = C_s, rz, 0 − C_p = 104, 167 − 0, 397 = 103, 769 [mM]

Obliczenie stopnia przereagowania:

$$\alpha = \frac{C_{p}}{C_{s,rz,0}} \bullet 100\% = \frac{0,397}{104,167} \bullet 100\% = 0,381\%$$

Na podstawie wykonanych obliczeń sporządzono wykres zależności stężenia produktu od czasu reakcji (C_p=f(t_r)). Posługując się regresją liniową wyznaczono równanie prostej:

y = 0,9264x + 0,1631

Na podstawie otrzymanego równania, pamiętając, że na sporządzonym wykresie współczynnik a jest równy szybkości reakcji, określono szybkość reakcji:

$$r = 0,9264\ \lbrack\frac{\text{mM}}{\min}\rbrack$$

Reaktor	Cs	r	1/Cs	1/r
[-]	[mM]	[mM/min]	[1/mM]	[min/mM]
1	1666,667	0,651	0,001	1,536
2	833,333	1,297	0,001	0,771
3	416,667	0,9	0,002	1,111
4	208,333	0,937	0,005	1,067
5	104,167	0,926	0,010	1,080
6	34,75	0,602	0,029	1,661
7	11,583	0,199	0,086	5,025
8	3,833	0,216	0,261	4,630
9	1,25	0,0731	0,800	13,680

Na podstawie otrzymanych wyników, umieszczony w powyższej tabeli, sporządzono wykres Michaelisa-Menten oraz Lineweavera-Burk'a. Odrzucono wyniki otrzymane dla reaktora 2, ponieważ wyraźnie odstawały od pozostałych punktów.

Na podstawie sporządzonego wykresu zaobserwowano wyraźną różnicę pomiędzy otrzymanym przebiegiem wykresu, a jego typowym kształtem. Na tej podstawie mogliśmy sądzić, iż występuje pewien rodzaj inhibicji, dodatkowo znajomość kształtów jakie przybiera zależność M-M dla określonych rodzajów inhibicji pozwoliła nam przypuszczać, że mamy do czynienia z inhibicją substratową.

Na otrzymanym wykresie podwójnych odwrotności również możemy zauważyć znaczne odchylenie od typowego kształtu krzywej, co jedynie utwierdziło nas w przekonaniu o występowaniu inhibicji substratowej. Parametry równania kinetycznego metodą regresji liniowej obliczono dla punktów wykresu Lineveawera-Burk'a tworzących linię prostą, odrzucając punkty wykazujące wyraźne odchylenie.

Na podstawie otrzymanego równania obliczono parametry kinetyczne:

y = 29,651x + 0,8158

$$V_{\max} = \frac{1}{0,8158} = 1,2258\ \frac{\text{mM}}{\min}$$

K_m = 29, 651 • 1, 2258 = 36, 346 mM

Stałe kinetyczne wyznaczone w programie OriginPro 9:

Wyniki otrzymane za pomocą regresji liniowej w Excelu posłużyły jako oszacowane wartości parametrów kinetycznych (V_max i K_M).

Stosunkowo duży błąd otrzymano dla wartości stałej Michaelisa-Menten. Pozostałe parametry kinetyczne były o rząd większe niż otrzymane błędy standardowe.

• Obliczenia k₃ oraz V_{max 2}:

V_max = C_E • k₃

$$\text{\ \ \ \ \ }k_{3} = \frac{V_{\max}}{C_{E}} = \frac{1,2258}{0,0067} = 182,954$$

V_max2 = k₃ • C_ef = 182, 954 • 0, 0417 = 7, 629

• Obliczenia oraz wyniki dla reaktora okresowego:

Vmax	1,267
Km	38,53
Kis	1489,315

Cs,rz,0	t	A	Cp	As	As,śr	Cs	α	tm
[mM]	[min]	[-]	[mM]	[-]	[-]	[mM]	[%]	[min]
104,167	0,25	0,055	3,773	1,076	1,093	100,394	3,622	4,304
	1,06	0,103	7,066	1,076		97,101	6,783	8,089
	2,18	0,186	12,759	1,128		91,408	12,249	14,705
	3,02	0,214	14,680	1,126	1,163	89,487	14,093	16,959
	3,29	0,265	18,178	1,139		85,989	17,451	21,096
	5,1	0,321	22,020	1,225		82,147	21,139	25,689
	6	0,365	25,038	1,196	1,166	79,129	24,037	29,338
	8,05	0,452	31,006	1,107		73,161	29,766	36,674
	10,03	0,581	39,855	1,194		64,312	38,261	47,901
	15,09	0,771	52,889	1,173	1,155	51,278	50,773	65,474
	20	0,927	63,590	1,085		40,577	61,046	81,299
	25,06	1,03	70,655	1,208		33,512	67,829	92,832
	30,04	1,167	80,053			24,114	76,851	110,402
	34,58	1,309	89,794			14,373	86,202	133,925
	40,22	1,315	90,206			13,961	86,597	135,136
	45,03	1,468	100,701			3,466	96,673	185,840
	50	1,479	101,456			2,711	97,397	193,904
	56,16	1,579	108,316	107,63		-4,149	103,983	-
	59,59	1,683	115,450			-11,283	110,831	-
	70,04	1,517	104,063			0,105	99,900	294,979
	79,5	1,497	102,691			1,476	98,583	213,362

Przykładowe obliczenia:

Obliczenie stężenia produktu:

$$C_{p} = \ \frac{A \bullet C_{\text{stand.}}}{A_{s,\ sr}} \bullet R = \ \frac{0,055 \bullet 15}{1,093} \bullet 5 = 3,773\lbrack mM\rbrack$$

Obliczenie stężenia substratu:

C_s = C_s, rz, 0 − C_p = 104, 167 − 3, 773 = 100, 394 [mM]

Obliczenie stopnia przereagowania:

$$\alpha = \frac{C_{p}}{C_{s,0,rzecz}} \bullet 100\% = \frac{3,773}{104,167} \bullet 100\% = 3,622\ \lbrack\%\rbrack$$

Obliczenie czasu modelowego:

$$t_{m} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet K_{M} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \frac{1}{{2 \bullet K}_{\text{is}}} \bullet \left( C_{0,s}^{2} - C_{s}^{2} \right)$$

$$t_{m} = \frac{1}{1,267} \bullet 38,53 \bullet \ln\left( \frac{104,167}{100,394} \right) + 104,167 - 100,394 + \frac{1}{2 \bullet 1489,32} \bullet \left( {104,167}^{2} - {100,394}^{2} \right) = 4,34\ \lbrack min\rbrack$$

• Wykres zależności stężenia substratu od czasu rekcji (w celu pozbycia się kilku pomiarów otrzymanych po całkowitym przereagowaniu substratu, punkty te uśredniono i przyjęto dla nich najniższą wartość czasu):

Wykres zależności czasu eksperymentalnego (mierzonego w czasie reakcji) oraz czasu modelowego (obliczonego) od stężenia substratu:

Na podstawie analizy otrzymanych wykresów dla czasu modelowego (T_m) oraz dla czasu eksperymentalnego (t_eks) stwierdzono znaczną rozbieżność pomiędzy czasem eksperymentalnym, a modelowym. Kształt obu wykresów, jak również fakt, iż w początkowym etapie oba wykresy zbiegają się w jednym punkcie ponownie utwierdza nas w przekonaniu, że mamy do czynienia z inhibicją substratem.

Ponieważ linia czasu modelowego znacząco odbiega od linii czasu eksperymentalnego zaistniała konieczność zmiany wartości V_max na wartość V_max2.

• Obliczenia dla V_max2:

Vmax	7,63
Km	38,53
Kis	1489,315

Cs,rz,0	t	A	Cp	As	As,śr	Cs	α	tm
[mM]	[min]		[mM]			[mM]	[%]	[min]
104,167	0,25	0,055	3,773	1,076	1,093333	100,394	3,62	0,715
	1,06	0,103	7,065549	1,076		97,101	6,78	1,343
	2,18	0,186	12,75915	1,128		91,408	12,25	2,442
	3,02	0,214	14,67988	1,126	1,163333	89,487	14,09	2,816
	3,29	0,265	18,17835	1,139		85,989	17,45	3,503
	5,1	0,321	22,01982	1,225		82,147	21,14	4,266
	6	0,365	25,03811	1,196	1,165667	79,129	24,04	4,872
	8,05	0,452	31,0061	1,107		73,161	29,77	6,090
	10,03	0,581	39,85518	1,194		64,312	38,26	7,954
	15,09	0,771	49,7063	1,173	1,155333	54,461	47,72	10,136
	20	0,927	59,76361	1,085		44,403	57,37	12,529
	25,06	1,03	66,40401	1,208		37,763	63,75	14,242
	30,04	1,167	75,23639			28,931	72,23	16,770
	34,58	1,309	84,22219			19,945	80,85	19,846
	40,22	1,315	84,60824			19,559	81,22	19,996
	45,03	1,468	94,45239			9,715	90,67	24,832
	50	1,479	95,16014			9,007	91,35	25,308
	56,16	1,579	102,5029	101,854		1,664	98,40	34,801
	59,59	1,683	109,2542			-5,087	104,88	-
	70,04	1,517	98,47807			5,689	94,54	28,065
	79,5	1,497	97,17975			6,987	93,29	26,856

Obliczenia przeprowadzono identycznie jak dla Vmax.

Na podstawie otrzymanych wyników ponownie sporządzono wykres zależności czasu eksperymentalnego (mierzonego w czasie reakcji) oraz czasu modelowego (obliczonego) od stężenia substratu:

Wykres czasu modelowego oraz czasu eksperymentalnego w dalszym ciągu nie pokrywają się w całości, jednak wartość rozbieżności jest znacznie niższa niż przed obliczeniem i użyciem V _max2.

5. Wnioski:

Celem ćwiczenia było zapoznanie się procedurą wyznaczania, a także wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji hydrolizy sacharozy. Na podstawie otrzymanych wyników, możemy stwierdzić, iż cel ćwiczenia niewątpliwie został zrealizowany, natomiast poprawność otrzymanych wyników budzi nieco wątpliwości.

Obliczenia sporządzone dla reaktorów 1-9 pracujących przy różnych stężeniach substratu pozwoliły otrzymać dane dla początkowych etapów reakcji. Opracowując otrzymane dane udało nam się wstępnie oszacować wartości parametrów kinetycznych, które następnie zostały wprowadzone do programu OriginPro9,0, a także pozwoliły nam podjąć decyzję przy wyborze odpowiedniego modelu. Za pomocą sporządzonych wykresów na podstawie wyników otrzymanych w reaktorach 1-9 udało nam się ustalić, iż mamy do czynienia z inhibicją substratową, ponieważ przy dużych stężeniach substratu szybkość reakcji gwałtownie maleje, co doskonale obrazuje otrzymany wykres Michaelisa-Menten, przy czym pozostałe wykresy jedynie potwierdziły nasze przypuszczenia. To stwierdzenie było kluczowe dla podjętych następnie kroków - wyznaczenie parametrów metodą regresji nieliniowej za pomocą programu OriginPro, który wymaga od nas znajomości modelu reakcji, jakiemu podlega badane zjawisko.

Na podstawie otrzymanych wyników możemy stwierdzić, iż regresja liniowa wykonana za pomocą programu Microsoft Excel nie sprawdza się w przypadku istnienia inhibicji. Nie dość, że niemożliwym jest obliczenie wartości stałej inhibicji (K_is) to otrzymane wartości pozostałych parametrów kinetycznych odbiegają od rzeczywistości. Regresja nieliniowa opracowana za pomocą programu OriginPro9,0 jest najlepszym możliwym rozwiązaniem tego typu problemu. Sporządzenie wykresu czasu modelowego i eksperymentalnego od stężenia substratu potwierdziło nasze założenia dotyczące inhibicji substratowej. Należy jednak pamiętać, iż program ma ograniczone możliwości jeśli chodzi o operowanie na wynikach błędnie wykonanego doświadczenia.

Niestety, nie udało nam sie uzyskać nazbyt poprawnych wyników. Nawet po zastosowaniu w obliczeniach drugiej prędkości maksymalnej pozostała niewielka rozbieżność pomiędzy przebiegiem poszczególnych czasów (eksperymentalnego i modelowego). Bezpośrednim powodem zaistniałej sytuacji jest błąd popełniony przy wyznaczeniu parametrów kinetycznych. Pośrednim może być natomiast błędnie przyjęty model, czy też niepoprawne wyniki otrzymane na drodze popełnionych błędów podczas wykonywania doświadczenia. Ponadto sam program OriginPro9,0 wyświetlając nam błąd statystyczny uświadomił nas o prawdopodobnie niepoprawnie wyznaczonej stałej Michaelisa-Menten.

Należy pamiętać, iż wykonana przez nas metoda jest mikrometodą, co oznacza, że należało bardzo dokładnie pipetować odpowiednie objętości roztworów, a także dbać o czystość używanego szkła laboratoryjnego[15]. Ze względu na przebieg doświadczenia i podział poszczególnych obowiązków pomiędzy utworzone podgrupy należy pamiętać, iż nie mieliśmy wpływu na dokładność wykonania pomiarów innych niż te, które zostały nam przydzielone. Jest to szczególnie istotne biorąc pod uwagę fakt, iż osoba dozująca enzym początkowo pomyliła stężenie enzymu, dlatego też wyniki otrzymane w grupie 12 dla reaktora pracującego do wyczerpania substratu były błędne. Wiązało się to z koniecznością wykorzystania pomiarów dla tego reaktora, które pochodziły z innej grupy ćwiczeniowej, co oczywiście nie gwarantowało iż otrzymane wyniki będą sie zgadzały z tymi, które otrzymaliśmy dla reaktorów 1-9.

Na podstawie otrzymanych pomiarów udało nam się otrzymać wartość stałej Michaelisa-Menten równej 38,53 mM. Nie jest to jednak wartość zadowalająca. Rożne źródła literaturowe podają odmienne wartości stałej K_M w zależności od organizmu, z którego została wyizolowana inwertaza, ale jej wartości wahają sie w granicach od 2-5mM. Ponadto, zgodnie z informacją od osoby prowadzącej zajęcia nie otrzymaliśmy czystego enzymu - inwertazy, a jedynie mieszankę różnych enzymów, która miała jedno, jasno określone zadanie - działać. Możliwe, że domieszki pozostałych enzymów mogły wpłynąć na otrzymane wartości parametrów kinetycznych. [2]

6.Przypis:

[1] - " Inwertaza - izolowanie enzymu i wykrywanie jego aktywności", Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa, Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów Opakowaniowych. Dostępny w Internecie: http://cbimo.zut.edu.pl/download/dydaktyka/enzymologia_-_ii_st_i__i_semestr/enzymologia_-_cwiczenia/C%C2%86wiczenie%206%20-%20Inwertaza.pdf,

[2] - Nam Sun Wang, "Experiment no.14, Enzyme kinetics of invertase via initial rate determination", Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Maryland. Dostępny w Internecie: http://terpconnect.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htm,

[3] - Barbara Hawrylak, Barbara Wolska-Mitaszko, "Inwertazy roślinne - funkcja fizjologiczna, regulacja aktywności oraz wykorzystanie w biotechnologii". Dostępny w Internecie: http://www.pfb.info.pl/files/kwartalnik/2_2007/hawrylak-wolska.pdf

[4] - http://www.ciam.pl/skladnik-e1103,

[5] - Adam Kuzdraliński, "Inwertaza". Artykuł dostępny w InternecieL http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Inwertazy/,

[6] -http://laboratoria.net/pl/artykul/Inwertaza%20%E2%80%93%20enzym%20pozyskiwany%20z%20kom %C3%B3rek%20dro%C5%BCd%C5%BCowych%3A%20wybrane%20metody%20izolacji,oznaczania%20i%20oczyszczania;19764.html

[7] - Bolesław Tabiś, "Zasady inżynierii reaktorów chemicznych", Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa.

[8] - http://bcpw.bg.pw.edu.pl/Content/144/sgpp_III1.pdf.

[9] - Notatki własne, Inżynieria bioreaktorów - wykład prowadzony przez prof. Andrzeja Noworytę,

[10] - http://www.wisegeek.com/what-are-batch-reactors.htm,

[11] - http://solve.nitk.ac.in/dmdocuments/theory_batch%20reactor.pdf,

[12] - Krzysztof W. Szewczyk, "Technologia biochemiczna", Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 2003,

[13] - http://pslc.ws/macrog/exp/rubber/synth/process.htm,

[14] - http://www.emersonprocessxperts.com/articles/ChemicalProcessing/Improve-Batch-Reactor-Temperature-Control.pdf.

[15] - Instrukcja „Inwertaza” laboratorium „Inżynierii bioreaktorów”, Politechnika Wrocławska, Wrocław.