2013/14 sem. letni

Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy

(inwertaza)

Cel ćwiczenia: zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania

kinetycznego

MATERIAŁY I METODY

Materiały

- inwertaza otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;

- 2 M roztwór sacharozy;

- 0.1 M bufor octanowy, pH 4.5;

- odczynnik do oznaczania stężenia glukozy – odczynnik I

Aparatura specjalna

- spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;

- termostatowane reaktory mieszalnikowe

Metody

Przygotowanie roztworów

Substrat. Do cylindra miarowego na 100 ml wprowadzić 50 ml 2M sacharozy (roztwór 1),

dodać 50 ml 0.1 M buforu octanowego i dobrze wymieszać (roztwór 2). Następnie 50 ml

świeżo przygotowanego roztworu wlać do kolejnego cylindra miarowego i uzupełnić

buforem do 100 ml (roztwór 3). Analogicznie przygotować roztwory 4 i 5 przez 2-krotne

rozcieńczenie roztworu poprzedzającego. Kolejne 4 roztwory przygotować przez 3-krotne

rozcieńczenia (15 ml roztworu sacharozy + 30 ml buforu). Należy pamiętać o dokładnym

wymieszaniu roztworów.

Enzym. Przygotować 20 ml roztworu wyjściowego inwertazy o stężeniu 1 mg/ml w 0.1 M

buforze octanowym. Dobrze wymieszać. Przygotować przez rozcieńczenie 2 roztwory

enzymu:

I – do badań kinetycznych – 25x (2 ml E + 48 ml buforu);

II – do procesu w reaktorze okresowym – 4x (2,5 ml E + 7,5 ml buforu).

Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.

Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu

glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ten ostatni reaguje w obecności

peroksydazy z kwasem hydrobenzoesowym (HBA) i 4-aminoantypiryną (AAP) tworząc

czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości

fali 500 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.

Glukoza + O

2

+ H

2

O

kwas glukonowy +H

2

O

2

H

2

O

2

+ HBA + AAP

chinonoimina + 4 H

2

O

Odczynniki: Odczynnik I (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP,

HBA, bufor fosforanowy), stabilizowany standard glukozy 15 mM.

Oznaczanie stężenia glukozy. Do suchych i czystych probówek wprowadzić po 1 cm

3

odczynnika do oznaczania glukozy. Przygotować również 4 probówki na standardy

glukozowe i kontrolę (próbkę do zerowania aparatu). Z reaktorów pobierać próbki po 10 ul

(lub 50 ul w przypadku reaktora 8 i 9) i dozować je bezpośrednio do probówek

zawierających odczynnik I. Analogicznie postąpić ze standardami i kontrolą (próbka do

zerowania aparatu). Każdorazowo kilkakrotnie przepłukać końcówkę odczynnikiem I.

Probówki pozostawić przez 5 min w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni, a następnie

zmierzyć absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej (1 ml odczynnika I + 10 ul 0,1 M

buforu octowego pH 4,5).

Obliczanie stężenia glukozy. Wartości absorbancji dla 3 standardów glukozy uśrednić i

przyjąć, że C

śr

= 7,5 mM. Z proporcji obliczyć stężenie w próbkach badanych, a otrzymane

wartości pomnożyć przez (ewentualne) rozcieńczenie. W efekcie otrzymuje się stężenie

glukozy w mM roztworu reakcyjnego.

Pomiar zmiany stężeń reagentów w początkowych etapach reakcji.

Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach:

Nr reaktora

1

2

3

4

5

6

7

8

9

C

sacharozy

[M]

2,0

1,0

0,5

0,25

0,125

0,0417 0,0139 0,0046 0,0015

Do termostatowanych (35



C) reaktorów mieszalnikowych wprowadzić po 20 cm

3

przygotowanych roztworów, włączyć mieszanie i zamknąć korkiem. Po 10-15 min

preinkubacji do reaktorów wprowadzić kolejno dokładnie po 4 ml roztworu enzymu (I),

włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrać z reaktora dokładnie 10 ul (lub 50 ul)

mieszaniny reakcyjnej i dodać do probówki zawierającej 1 cm

3

odczynnika I. Probówkę

zamieszać i wstawić na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni. Kolejne próbki do

Oksydaza glukozowa

Peroksydaza

analiz pobierać po 1, 2, 3, 4 i 5 minucie lub po 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów (1), (2) i

(3)).

Pomiar zmiany stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy

Do

termostatowanego

(35



C) reaktora mieszalnikowego wprowadzić 20 cm

3

przygotowanego roztworu substratu nr 5, włączyć mieszanie i zamknąć korkiem. Po 10-15

min preinkubacji do reaktora wprowadzić 4 ml roztworu enzymu (II), włączając jednocześnie

stoper. Po 10-15 sec pobrać z reaktora 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodać do probówki

zawierającej 0,4 cm

3

0,1 M buforu octowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek).

Probówkę zamieszać i pobrać z niej 10 ul i postępować jak opisano wcześniej. Kolejne

próbki do analiz pobierać po 5, 10, 15, 20 min, a następne co 10 min. Uwzględnić 5-krotne

rozcieńczenie próbki pobranej z reaktora.

Sprawozdanie winno zawierać: wstęp (np. o enzymie, jego wykorzystaniu w przemyśle),

metodykę (należy pamiętać o formie bezosobowej np. dodano, zmierzono...), przykładowe

obliczenia, wyniki i dyskusję wyników.

Uwaga! Enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy jest mikrometodą. Zlewki,

cylindry, probówki, itd. należy przed myciem przepłukać wodą z kranu, następnie

umyć wodą z dodatkiem niewielkiej ilości “Ludwika”, po czym płukać dużą ilością

wody z kranu (15x) i 3x wodą destylowaną. I należy pamiętać, że wszystko ma też

powierzchnię zewnętrzną. Ponieważ wszystkie grupy ćwiczeniowe korzystają z tego

samego szkła, nieuwaga 1 osoby może być przyczyną złych wyników grup następnych.

Konsekwencje braku utrzymania odpowiedniej czystości szkła laboratoryjnego: kłopoty

z wyznaczeniem stałych równania kinetycznego, brak możliwości symulacji procesu w

reaktorze okresowym, problemy z oceną z ćwiczeń.

Zagadnienia na kartkówkę:

1.

Rodzaje inhibicji i jak zmieniają się parametry kinetyczne.

2.

Założenia potrzebne do wyprowadzenia równania M-M.

3.

Równanie Michaelisa-Menten.

4.

Znajomość instrukcji.

5.

Proszę przynieść kalkulatory!