Wstęp teoretyczny

Reakcje chemiczne w organizmach żywych zwykle zachodzą w obecności katalizatorów, zwanych enzymami. Pierwszy etap reakcji enzymatycznej to utworzenie kompleksu enzym-substrat [ES]. Substrat wiąże się ze specyficznym miejscem na cząsteczce enzymu, zwanym centrum aktywnym i przekształca się w produkt reakcji. W następnym etapie kompleks [EP] rozpada się z powrotem na wolny enzym i produkt (ew. produkty). Najprostszy schemat reakcji enzymatycznej przedstawia się następująco:

[E] + [S] [ES] [E] + [P]

Miara aktywności enzymu to początkowa szybkość reakcji przez niego katalizowanej, wyliczana z tak zwanej krzywej progresji. Pokazuje ona zależność ilości przetworzonego substratu (Δ[S]) lub powstałego w reakcji produktu (Δ[P]) od czasu jej trwania: [S] = f(t) lub [P] = f(t). Krzywa progresji obrazuje przebieg reakcji enzymatycznej w obecności enzymu o stałym stężeniu ([E] = const) i przy zadanym początkowym stężeniu substratu ([S₀] = const). Na początku reakcji krzywa progresji jest funkcją liniową (tzn. Δ[P] i Δ[S] są wprost proporcjonalne do czasu), jednak po dłuższym czasie szybkość reakcji spada. Dlatego też szybkość początkowa reakcji stanowi podstawę do określenia aktywności enzymu i wyprowadzenia jego właściwości kinetycznych.

Źródło: http://www.chem.uw.edu.pl/people/AMyslinski/cw13/enzymy.html

Charakterystyczną wielkością oznaczoną jako K_m jest stała Michaelisa, czyli stężenie substratu, w którym szybkość reakcji równa jest połowie szybkości maksymalnej. Jest to również takie stężenie substratu, przy którym połowa cząsteczek enzymu została związana w kompleks [ES]. Zależność między szybkością reakcji, V_max, stałą K_m i [S] przedstawia równanie Michaelisa-Menten:

K_m obrazuje zdolność wiązania się substratu do danego enzymu, natomiast odwrotność K_m liczbowo określa powinowactwo enzymu do substratu i taka zależność to równanie Lineweavera-Burka:

W naszym ćwiczeniu badania kinetyczne prowadzone były na przykładzie reakcji katalizowanej przez enzym INWERTAZĘ (β-fruktofuranozydazę, EC 3.2.1.26). Inwertaza to enzym należący do klasy hydrolaz i podklasy hydrolaz glikozydowych, który hydrolizuje disacharyd sacharozę do cukrów prostych fruktozy i glukozy (rozrywa wiązanie glikozydowe). Sacharoza jest bezbarwnym krystalicznym ciałem stałym, dobrze rozpuszcza się w wodzie i jest składnikiem cukru trzcinowego i buraczanego. Jest również cukrem nieredukującym, natomiast produkty jej hydrolizy to cukry redukujące, w związku z czym aktywność enzymu można obliczyć na podstawie pomiaru ich stężeń.

Inwertazę zwykle uzyskuje się z drożdży piekarniczych, choć znajduje się ona również w komórkach roślinnych (ściana komórkowa) oraz u człowieka, na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka jelita cienkiego. Jest aktywna w szerokim zakresie pH od 4 do 6 z optimum działania w pH około 4,7, natomiast enzym jest nieaktywny przy pH 2 i 9.

Inwertazę stosuje się w przemyśle spożywczym przy produkcji soków, mleka, wina oraz wyrobów cukierniczych. Pełni ona funkcję stabilizatora, zapobiegając krystalizacji cukru i utrzymując odpowiedni poziom wilgotności.

W ćwiczeniu wykorzystany został reaktor okresowy. Taki reaktor charakteryzuje się tym, że wymiana reagentów jest prowadzona cyklicznie (okresowo). Proces w nim zachodzący jest procesem nieustalonym, to znaczy że stężenie zmienia się w czasie, ale jest wyrównane w całej objętości reaktora. Substrat w reaktorze jest dokładnie mieszany, po czym następuje opróżnienie reaktora i proces można zacząć ponownie.

ŹRÓDŁA:

• Skrypt do laboratorium z Instytutu Biochemii Politechniki Łódzkiej, ćw. nr 6 „Kinetyka reakcji enzymatycznych
  (część II)”

• http://portalwiedzy.onet.pl/26180,,,,inwertaza,haslo.html

• http://pl.wikipedia.org/wiki/Inwertaza

• J.M.Berg, J.L.Tymoczko, L.Stryer, BIOCHEMIA wydanie piąte, Warszawa 2005, Wydawnictwo Naukowe PWN SA, s. 189-225

• http://portalwiedzy.onet.pl/33032,,,,sacharoza,haslo.html

• http://pl.wikipedia.org/wiki/Sacharoza

• Inżynieria Bioreaktorów, prof. Andrzej Noworyta, notatki z wykładu

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych kinetycznych równania kinetycznego.

Materiały

• inwertaza otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;

• 2 M roztwór sacharozy;

• 0.1 M bufor octanowy, pH 4.5;

• odczynnik do oznaczania stężenia glukozy - odczynnik I (oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP, HBA, bufor fosforanowy)

Aparatura specjalna

• spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;

• termostatowane reaktory mieszalnikowe

Wykonanie ćwiczenia

Pierwszym etapem było przygotowanie roztworów substratu i enzymu, używanych w dalszej części ćwiczenia. Substrat: do cylindra miarowego o pojemności 100 ml wprowadzono 50 ml 2M roztworu sacharozy („roztwór 1”), dodano 50 ml 0,1M roztworu buforu octanowego i dobrze wymieszano („roztwór 2”). Następnie tak utworzony roztwór w ilości 50 ml przelano do kolejnego cylindra i uzupełniono buforem do 100 ml, otrzymując roztwór 2x rozcieńczony od poprzedniego („roztwór 3”). Podobnie postąpiono z roztworami 4 i 5 (dwukrotne rozcieńczenia). Pozostałe 4 roztwory przyrządzono, pobierając 15 ml roztworu sacharozy i 30 ml buforu, rozcieńczając je kolejno trzykrotnie. Enzym: Przygotowano 20 ml roztworu wyjściowego enzymu inwertazy o stężeniu C₀ równym 1 mg/ml w 0,1M buforze octanowym, dobrze wymieszano. Poprzez rozcieńczenie, przygotowano 2 osobne roztwory enzymu: do badań kinetycznych (I, stężenie 25x, 2 ml enzymu + 48 ml buforu octanowego) i do procesu w reaktorze okresowym (II, stężenie 4x, 2,5 ml enzymu + 7,5 ml buforu).

Następnie przygotowano test enzymatyczny do oznaczania glukozy. Do czystych, suchych probówek wprowadzono po 1 ml odczynnika do oznaczania glukozy („odczynnik I”). Przygotowano również 4 probówki na standardy glukozowe (3) i kontrolę do zerowania aparatu spektrofotometrycznego (1).

W kolejnej części do termostatowanych reaktorów mieszalnikowych ustawionych na temp.35°C wprowadzono po 20 ml przygotowanych wcześniej roztworów o zadanych stężeniach, zamknięto korkiem i włączono mieszanie. Po 15 min do reaktorów wprowadzono po 4 ml roztworu enzymu (I), jednocześnie włączono stoper i po 15 sek pobierano 10 μl mieszaniny z reaktora i wprowadzano do probówek z 1 ml odczynnika I (50 μl w przypadku reaktorów nr 8 i 9). Probówki mieszano i wstawiano na 5 min do łaźni wodnej (37°C). Kolejne próbki do analiz pobierano w odstępach czasowych: 1, 2, 3, 4 i 5 min oraz 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów 1, 2 i 3). Po inkubacji w łaźni, badano absorbancję próbek przy 500 nm wobec próby kontrolnej (1 ml odczynnika I + 10 ul 0,1 M buforu octowego pH 4,5). Zapisano wyniki.

Wartości absorbancji dla 3 standardów glukozy uśredniono dla każdego reaktora; przyjęto, że średnie stężenie glukozy wynosi 15 mM. Z proporcji policzono stężenie w próbkach badanych (vide tabele).

Wykonano również pomiar stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy. Do reaktora mieszalnikowego o temp. 35°C wprowadzono 20 ml roztworu nr 5, włączono mieszanie i zatkano korkiem. Po 15 min wprowadzono 4 ml roztworu enzymu (II), jednocześnie włączono stoper. Po 15 sek pobrano 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodano do probówki z 0,4 ml 0,1M buforu octanowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek). Zamieszano i pobrano 10 μl, postępując jak opisano wcześniej. Kolejne próbki do analiz pobierano po czasi 5, 10, 15 i 20 min, a następne już co 10 min.

Wyniki i obliczenia

REAKTOR 1		(próbka z reaktora V=10ul)
Csubstratu = 2000 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,25	0,202	3,09	1	0,986
2	2	2,17	0,292	4,46	2	0,963
3	4	4,17	0,407	6,22	3	0,996
4	6	6,08	0,342	5,23	średnia	0,982
5	8	8,05	0,474	7,24
6	10	10,03	0,451	6,89

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15nM standard glukozy - średnia absorbancja (0,982)

stężenie produktu X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby lepiej ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, usunięto punkty nr 4 i 6. Równanie prostej ma postać: y = 0,533x + 3,3028. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
1	2000	1663,36	3,3028

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 1:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 2:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 2:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,25	3,3028	1663,36	-0,216*	-0,013
2,17					1,159	0,070
4,17					2,916	0,175
6,08					1,923	0,116
8,05					3,94	0,237
10,03					3,589	0,216

* punkt nie był brany pod uwagę z racji, że stężenie produktu nie może być ujemne

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,309x + 0,3403 r = 0,309

REAKTOR 2		(próbka z reaktora V=10ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 1000 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,25	0,190	3,06	1	0,935
2	2	2,08	0,280	4,51	2	0,924
3	4	4,08	0,423	6,82	3	0,932
4	6	6,13	0,312	5,03	średnia	0,930
5	8	8,17	0,496	8,00
6	10	10,25	0,608	9,80

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,930)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby lepiej ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, usunięto punkty nr 3 i 4. Równanie prostej ma postać: y = 0,6467x + 2,9896. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
2	1000	830,34	2,9896

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 2:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 1:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 1:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,25	2,9896	830,34	0,074	0,004
2,08					1,525	0,092
4,08					3,831	0,230
6,13					2,041	0,123
8,17					5,008	0,301
10,25					6,813	0,410

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,6467x + 3E-05 r = 0,6467

REAKTOR 3		(próbka z reaktora V=10ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 500 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,33	0,135	2,10	1	0,961
2	2	2,17	0,217	3,38	2	0,941
3	4	4,17	0,359	5,59	3	0,986
4	6	6,08	0,320	4,99	średnia	0,963
5	8	8,10	0,436	6,79
6	10	10,12	0,503	7,84

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,963)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby lepiej ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, usunięto punkty nr 3 i 4. Równanie prostej ma postać: y = 0,5829x + 2,01. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
3	500	414,66	2,01

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 3:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 1:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 1:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,33	2,01	414,66	0,094	0,006
2,17					1,371	0,082
4,17					3,584	0,215
6,08					2,976	0,179
8,10					4,784	0,288
10,12					5,828	0,350

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,5829x - 1E-05 r = 0,5829

REAKTOR 4		(próbka z reaktora V=10ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 250 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,27	0,083	1,27	1	1,193
2	1	1,08	0,099	1,54	2	0,861
3	2	2,05	0,113	1,75	3	0,859
4	3	3,08	0,205	3,17	średnia	0,971
5	4	4,15	0,249	3,84
6	5	5,00	0,274	4,24

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,971)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby lepiej ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, usunięto punkt nr 3. Równanie prostej ma postać: y = 0,6662x + 1,0006. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
4	250	207,33	1,0006

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 4:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 1:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 1:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,27	1,0006	207,33	0,274	0,016
1,08					0,535	0,032
2,05					0,745	0,045
3,08					2,166	0,130
4,15					2,838	0,171
5,00					3,237	0,195

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,6662x + 4E-05 r = 0,6662

REAKTOR 5		(próbka z reaktora V=10ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 125 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,27	0,030	0,46	1	0,974
2	1	1,03	0,082	1,25	2	0,995
3	2	2,02	0,139	2,11	3	0,989
4	3	3,02	0,143	2,18	średnia	0,986
5	4	4,00	0,203	3,09
6	5	5,00	0,214	3,26

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,986)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby lepiej ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, usunięto punkty nr 4 i 6. Równanie prostej ma postać: y = 0,6896x + 0,4652. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
5	125	103,7	0,4652

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 5:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 2:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 2:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,27	0,4652	103,7	-0,009*	-0,001
1,03					0,782	0,047
2,02					1,649	0,099
3,02					1,710	0,103
4,00					2,623	0,158
5,00					2,790	0,168

* punkt nie był brany pod uwagę z racji, że stężenie produktu nie może być ujemne

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,5028x + 0,396 r = 0,5028

REAKTOR 6		(próbka z reaktora V=10ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 41,7 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,30	0,025	0,25	1	1,540
2	1	1,02	0,073	0,73	2	1,439
3	2	2,03	0,127	1,26	3	1,540
4	3	3,02	0,211	2,10	średnia	1,506
5	4	4,03	0,276	2,75
6	5	5,12	0,374	3,72

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (1,506)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, nie było konieczne usuwanie jakichkolwiek punktów. Równanie prostej ma postać: y = 0,7133x - 0,0424. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
6	41,7	34,75	0*

* Z wykresu odczytano wartość -0,0424, jednak z racji, że stężenie to nie może być ujemne, wstawiono wartość 0.

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 6:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 1:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 1:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,30	0	34,75	0,249	0,015
1,02					0,727	0,044
2,03					1,265	0,076
3,02					2,101	0,126
4,03					2,748	0,165
5,12					3,724	0,224

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,7133x - 0,0424 r = 0,7133

REAKTOR 7		(próbka z reaktora V=10ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 13,9 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,26	0,020	0,31	1	0,950
2	1	1,12	0,045	0,70	2	0,952
3	2	2,13	0,056	0,87	3	1,003
4	3	3,25	0,058	0,90	średnia	0,968
5	4	4,08	0,061	0,94
6	5	5,12	0,085	1,32

Stężenie produktu policzono z proporcji:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,968)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Aby lepiej ukazać liniową zależność stężenia produktu od czasu, usunięto punkty nr 3 i 4. Równanie prostej ma postać: y = 0,1538x + 0,5309. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
7	13,9	11,05	0,5309

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 7:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 2:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 2:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,26	0,5309	11,05	-0,221*	-0,013
1,12					0,166	0,010
2,13					0,337	0,020
3,25					0,368	0,022
4,08					0,414	0,025
5,12					0,786	0,047

* punkt nie był brany pod uwagę z racji, że stężenie produktu nie może być ujemne

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,1538x - 6E-06 r = 0,1538

REAKTOR 8		(próbka z reaktora V=50ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 4,6 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,37	0,010	0,031	1	0,945
2	1	1,09	0,013	0,041	2	0,986
3	2	2,08	0,040	0,125	3	0,945
4	3	3,07	0,067	0,210	średnia	0,959
5	4	4,07	0,105	0,329
6	5	5,08	0,128	0,401

Stężenie produktu policzono z proporcji, dodatkowo uwzględniając inną objętość pobieranych z reaktora próbek, tj.50 ul zamiast 10ul:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,959)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Równanie prostej ma postać: y = 0,0839x - 0,0311. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
8	4,6	3,83	0*

* Z wykresu odczytano wartość -0,0311, jednak z racji, że stężenie to nie może być ujemne, wstawiono wartość 0.

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 8:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 1:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 1:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,37	0	3,83	0,031	0,002
1,09					0,041	0,002
2,08					0,125	0,008
3,07					0,210	0,013
4,07					0,329	0,020
5,08					0,401	0,024

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,0839x - 0,0311 r = 0,0839

REAKTOR 9		(próbka z reaktora V=50ul)	Cstandardu = 15 mM
Csubstratu = 1,5 mM
Próbka	Czas reakcji [min]	Czas rzecz.reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
1	0,25	0,37	0,009	0,028	1	0,971
2	1	1,09	0,015	0,046	2	0,968
3	2	2,06	0,018	0,055	3	0,980
4	3	3,04	0,027	0,083	średnia	0,973
5	4	4,05	0,037	0,114
6	5	5,06	0,043	0,133

Stężenie produktu policzono z proporcji, dodatkowo uwzględniając inną objętość pobieranych z reaktora próbek, tj.50 ul zamiast 10ul:

15mM standard glukozy - średnia absorbancja (0,973)

stężenie glukozy X - absorbancja poszczególnych próbek

np. dla próbki nr 1:
[mM]

Równanie prostej ma postać: y = 0,0227x + 0,0173. Wyraz wolny (b) oznacza początkowe stężenie glukozy (C_glukozy,0).

Reaktor	Csubstratu,0 [mM]	Csubstratu,rzecz,0 [mM]	Cglukozy,0 [mM]
9	1,5	1,23	0,0173

Rzeczywiste stężenie substratu liczone było z zależności:

Dla reaktora nr 9:
[mM]

Należało policzyć rzeczywiste stężenie produktu w próbkach:

Np. dla próbki numer 1:
[mM]

Policzono również stopień przereagowania α:

Np. dla próbki numer 1:
[%]

czas rzecz.reakcji [min]	Cglukozy,0 [mM]	Cs,rzecz,0 [mM]	Cproduktu [mM]	α [%]
0,37	0,0173	1,23	0,010	0,001
1,09					0,029	0,002
2,06					0,038	0,002
3,04					0,066	0,004
4,05					0,097	0,006
5,06					0,115	0,007

Z nowego wykresu wyznaczono wartość szybkości reakcji r:

y = 0,0227x + 2E-06 r = 0,0227

ZESTAWIENIE WYNIKÓW Z REAKTORÓW

Reaktor	Cs,rzecz,0 [mM]	r [mM/min]	1/Cs,rzecz,0 [1/mM]	1/r [min/mM]
1	1663,36	0,309	0,000601	3,236
2	830,34	0,6467	0,001204	1,546
3	414,66	0,5829	0,002412	1,716
4	207,33	0,6662	0,004823	1,501
5	103,70	0,5028	0,009643	1,989
6	34,75	0,7133	0,028777	1,402
7	11,05	0,1538	0,090498	6,502
8	3,83	0,0839	0,261097	11,919
9	1,23	0,0227	0,813008	44,053

W celu wykreślenia wykresu Lineweavera-Burka, policzono odwrotności szybkości reakcji oraz stężenia rzeczywistego substratu, a wyniki zestawiono w tabeli powyżej.

y = 51,547x + 1,265

V_max = 1/ 1,265 = 0,79

K_m = 51,547 / 1,265 = 40,75

Stężenie glukozy policzone zostało wg. wzoru:

Dla próbki nr 1:

REAKTOR OKRESOWY	C substratu=125 mM	C standardu = 15 mM
Czas reakcji [min]	Czas rzeczywisty reakcji [min]	Abs500nm	Cglukozy [mM]	STANDARD	Abs500nm
0,25	0,35*	0,107	8,845	1	0,959
1	1,10	0,061	5,042	2	0,898
2	2,10	0,072	5,952	3	0,963
3	3,10	0,115	9,506	4	0,853
4	4,10	0,177	14,631	5	0,938
5	5,10*	0,375	30,997	6	0,833
6	6,05	0,261	21,574	średnia	0,907
8	8,05	0,338	27,939
10	10,05	0,417	34,469
15	15,05	0,571	47,199
20	20,05	0,679	56,126
25	25,05	0,816	67,450
30	30,10*	0,846	69,930
35	35,05	1,016	83,982
40	40,15	1,119	92,496
45	45,20	1,103	91,174
50	50,05	1,190	98,365
55	55,05*	1,155	95,472
60	60,05	1,298	107,292
70	70,10	1,316	108,780
80	80,05*	1,181	97,621
85	85,55*	1,224	101,176
90	90,05	1,380	114,071

* USUNIĘTE PUNKTY

Sporządzono wykres początkowych warunków reakcji:

t rzecz.reakcji [min]	Cglukozy [mM]	Cproduktu [mM]	Cs,rz,o [mM]	Cs [mM]	tmodelowy [min]
1,10	5,042	2,392	101,516	99,124	0,600
2,10	5,952	3,301			98,215	0,829
3,10	9,506	6,855			94,661	1,725
4,10	14,631	11,980			89,536	3,024
6,05	21,574	18,924			82,592	4,803
8,05	27,939	25,288			76,228	6,453
10,05	34,469	31,819			69,698	8,173
15,05	47,199	44,548			56,968	11,623
20,05	56,126	53,475			48,041	14,154
25,05	67,450	64,800			36,716	17,574
30,10	83,982	81,332			20,184	23,410
35,05	92,496	89,846			11,670	27,421
40,15	91,174	88,523			12,993	26,704
50,05	98,365	95,715			5,801	31,546
60,05	107,292	104,642			-3,126 *	- **
70,10	108,780	106,130			-4,614 *	- **
90,05	114,071	111,420			-9,904 *	- **

* Ujemne wartości wynikają z faktu, że dla tych pomiarów stężenie produktu (C_produktu) jest większe od początkowe stężenia rzeczywistego substratu (C_s,rz,0).

** Z racji ujemnych wartości stężenia substratu, funkcja nie mogła zostać policzona.

Początkowe rzeczywiste stężenie substratu:

Stężenie substratu policzone zostało wg. wzoru:

Dla próbki nr 1:
[mM]

Wartość C_g,0 odpowiada wyrazowi wolnemu z wykresu funkcji dla r-ra okresowego: 2,6506

Stężenie produktu policzone zostało wg. wzoru: C_produktu = C_glukozy - C_g,0

Dla próbki nr 1: C_produktu = 5,042 - 2,6506 = 2,392 [mM]

Do programu Origin Pro 8 wprowadzono wyprowadzone wcześniej wartości K_m, V_max i założone K_is i za pomocą regresji nieliniowej oszacowano nowe wartości. Skorzystano ze wzoru:

Vmax		Km		Kis		Statistics
Value	Error	Value	Error	Value	Error	Reduced Chi-Sqr	Adj. R-Square
0,81807	0,19718	21,72886	16,18625	1515,975	1283,12	0,01768	0,7579

V_max,2 = V_max * 6,25 = 0,81807 * 6,25 = 5,113

[min]

Wnioski

Dane otrzymane z reaktorów od 1 do 9 poprzez odpowiednie obliczenia pozwoliły na nakreślenie wykresu szybkości reakcji od stężenia substratu. Jednak wykres odbiega od zwykłego modelu Michaelisa-Menten, co sugeruje inhibicję - szybkość reakcji spada dla dużych stężeń substratu (w zwykłym modelu przy wysokich stężeniach, miejsca aktywne enzymu są w pełni wysycane i szybkość nie zależy od stężenia). W naszym przypadku założyliśmy istnienie inhibicji substratowej.

Regresja liniowa wykonana za pomocą programu Microsoft Excel nie dostarcza wyczerpujących informacji na temat parametrów kinetycznych, w związku z czym posłużono się programem Origin Pro 8 , który wykorzystuje regresję nieliniową (Nonlinear Curve Fit). Otrzymano wartości parametrów reakcji: K_M, V_max oraz K_is (stała inhibicji substratowej), które następnie zweryfikowano w reaktorze okresowym, licząc czas modelowy reakcji. Porównanie czasu rzeczywistego i modelowego zobrazowano na wykresie powyżej - widać, że przy wysokich stężeniach substratu czasy pokrywają się, a następnie, w miarę zmniejszania się stężenia, krzywe zaczynają się „rozchodzić”. Oznacza to poprawnie wykonane założenia odnośnie inhibicji substratowej.

Otrzymane wyniki obarczone są jednak znacznym błędem. Wynika to między innymi z niedokładnego pipetowania, odmierzania czasu, sporządzania roztworów jak również faktu, że ćwiczenie wykonywane było przez kilka grup studentów, na które nie mieliśmy wpływu. Niedokładności pomiarowe zaistniałe już w pierwszych etapach wykonywania ćwiczenia rzutują na błędy kolejnych obliczeń i dalej na wynik końcowy. Pomimo tego, po usunięciu punktów znacznie odbiegających od pozostałych, udało się uzyskać sensowne wartości parametrów kinetycznych reakcji.

Sprawozdanie 1. Strona 1 z 23	Politechnika Wrocławska Wydział Chemiczny	Dr hab. Jolanta Bryjak, prof. PWr Pon, godz. 13:15, bud.C6/123A
Laboratorium Inżynieria Bioreaktorów	Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy	Wojciech Ślęczek 168560 Maciej Duda 168516

---