LABORATORIUM BIOTECHNOLOGII OGÓLNEJ

Biotechnologia

czwartek godz. 8¹⁵-12⁰⁰

Adam Cuperek

Katarzyna Świątek (4)

Paulina Kij

Stół III gr. 4

ĆWICZENIE nr 5

KINETYKA PROCESÓW FERMENTACYJNYCH

1. Wstęp teoretyczny.

Do kierowania procesami biosyntezy i biotransformacji mikrobiologicznej niezbędna jest znajomość fizjologii drobnoustrojów, fazowości procesów mikrobiologicznych oraz relacji między wzrostem szczepu, a tworzeniem produktów. W hodowli okresowej, fazy rozwoju odzwierciedlają zmiany w metabolizmie populacji drobnoustrojów. Widoczne są również zmiany we wzajemnym oddziaływaniu między komórkami a środowiskiem. Zmiany te są wynikiem konieczności adaptacji drobnoustrojów do zmieniających się warunków środowiskowych, na które składają się: wyczerpanie składników podłoża, nagromadzenie produktów metabolizmu oraz zmiana pH. Szlaki metaboliczne wytwarzające poszczególne produkty występują w komórce w zależności od fazy hodowli. Można więc stwierdzić, iż tworzenie produktu jest funkcją fazy wzrostu drobnoustrojów. Według Gadena opierając się na współzależności między wytwarzaniem produktu a zużywaniem substratu procesy fermentacyjne można sklasyfikować w trzech następujących grupach:

• I typ procesu - Bezpośrednio ze wzrostem związana jest synteza produktu. Przebiega ona równolegle z namnażaniem komórek, zanikając w fazie stacjonarnej hodowli.

• II typ procesu - Pośrednio ze wzrostem związane jest gromadzenie się produktu. Zachodzi ono w komórkach rosnących oraz nie rosnących.

• III typ procesu - Tworzenie produktu nie jest związane ze wzrostem, występuje ono tylko w komórkach nie namnażających się.

2. Cel ćwiczenia.

Celem ćwiczenia jest poznanie relacji między wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem produktów na przykładzie dwóch procesów biotechnologicznych: biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger oraz dekstranazy przez Penicillium funiculosum.

3. Wykonanie ćwiczenia.

1. Oznaczanie suchej masy grzybni (Aspergillus niger, Penicillium funiculosum).

Wyrośniętą wgłębnie grzybnię oddzielono od podłoża na lejku Buchnera, używając w tym celu bibuły filtracyjnej. Odmytą z resztek podłoża grzybnie suszono w temperaturze 55 ^oC przez 6 godzin i w temperaturze 35 ^oC w ciągu dwóch dni. Wyniki zawartości suchej masy grzybni przedstawiono w tabeli.

Doba	Sucha masa grzybni [g/l]
	Aspergillus niger
2	2,752
3	7,580
4	5,296
5	11,712
6	12,052
7	8,268

1. Oznaczanie kwasowości ogólnej przesączu ( Aspergillus niger).

Z przesączu uzyskanego po oddzieleniu grzybni, uzupełnionego do objętości dwukrotnie większej od pierwotnej objętości podłoża, pobrano próby w ilości 2 ml i miareczkowano 0,1n roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny.

Doba	Objętość NaOH [ml]
2	0,95
3	4,40
4	5,65
5	6,85
6	8,60
7	9,90

Obliczenia:

Przykładowe wyliczenie kwasowości ogólnej dla próby z drugiej doby:

1 cm³ 0,1 n NaOH - 0,0064g kwasu cytrynowego

0,95 cm³ 0,1 n NaOH - x g kwasu cytrynowego

x = 0,95·0,0064/1 = 0,00608 [g kwasu cytrynowego/ 2 ml]

0,00608·1000/2 = 3,04 [g kwasu cytrynowego/l]

Analogicznie wykonano obliczenia dla pozostałych prób. Wyniki przedstawiono w tabeli zbiorczej.

Doba	Kwasowość [g kwasu cytrynowego/ l]
	I
2	2,2
3	11,8
4	37,1
5	46,7
6	60,8
7	64,0

Kwasowość – tabela zbiorcza dla wszystkich grup.

Wykres zmiany stężenia biomasy i zmiany stężenia produktu w ciągu siedmiu dni dla wyników grupy czwartej.

Kwasowość [g kw.cytr./ l] (p-produkt)	dp/dt	Aspergillus niger [g/l] (x-biomasa)	dx/dt
3,04	11,04	2,752	2,752
14,08	22,08	7,58	4,828
36,16	7,68	5,296	0
43,84	9,2	11,712	6,416
53,04	10,32	12,052	0,34
63,36	0	8,268	0

Wykres przyrostu biomasy i przyrostu produktu w ciągu siedmiu dni dla wyników grupy czwartej.

1. Oznaczanie aktywności dekstranazy ( Penicillium funiculosum).

Reakcję enzymatyczną prowadzono w łaźni wodnej o temperaturze 50 ^oC. 0,5 ml roztworu dekstranu zmieszano z 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonej cieczy pohodowlanej i po 10 minutach oznaczono wytworzone cukry redukujące w reakcji z odczynnikiem Somogyi – Nelsona: do mieszaniny reakcyjnej wprowadzono 1 ml odczynnika miedziowego, umieszczono na 10 minut we wrzącej łaźni wodnej, schłodzono do temperatury pokojowej i dodano 1 ml odczynnika Nelsona. Barwny roztwór, w zależności od intensywności barwy, dopełniono do 25 ml. Absorbancję odczytano przy długości fali λ= 520 nm wobec próby kontrolnej zawierającej 0,5 ml substratu.

Doba	Absorbancja	A [µgIM/ml]	Rozcieńczenie	Aktywność dekstranazy [J/ml]
2	0,155	240,25	200	28,10
3	0,175	270,25	300	47,41
4	0,155	240,25	500	70,25
5	0,150	232,50	500	67,98
6	0,120	186,00	500	54,39

Obliczenia:

Aktywność dekstranazy wyliczono ze wzoru:

x = $\frac{A*2*B}{342*10}$

Gdzie:

A - ilość μg izomaltozy w 1 ml analizowanego roztworu odczytana z krzywej wzorcowej

B - rozcieńczenie cieczy pohodowlanej

2 - rozcieńczenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej

342 - mikromol izomaltozy

10 - czas reakcji enzymatycznej, 10 minut

Przykładowe wyliczenie aktywności dekstranazy dla próby z drugiej doby:

- wyliczenie A z zależności:

0,1 – 155 [µgIM/ml]

0,155 – A

A = (155·0,155)/0,1 = 240,25 [µgIM/ml]

- wyliczenie aktywności:

[J/ml]

Doba	Aktywność dekstranazy [J/ml]
	I
2	35
3	57
4	99
5	91
6	97

Aktywność dekstranazy – tabela zbiorcza dla wszystkich grup.

Wykres zmiany stężenia biomasy i zmiany stężenia produktu w ciągu siedmiu dni dla wyników grupy czwartej.

Aktywność dekstranazy [J/ml] (p-produkt)	dp/dt	Penicillium funiculosum [g/l] (x-biomasa)	dx/dt
28	14	4,244	4,244
47	19	3,936	0
70	23	3,36	0
67	0	2,788	0
54	0	1,968	0

Wykres przyrostu biomasy i przyrostu produktu w ciągu siedmiu dni dla wyników grupy czwartej.

4. Wnioski.

1). Analizując obliczenia i wykres można wnioskować, iż największa produkcja kwasu cytrynowego występuje w fazie stacjonarnej rozwoju komórek pleśni Aspergillus niger. Kwas cytrynowy jest wytwarzany zarówno przez komórki rosnące jak i nie rosnące, fakt ten pozwala zakwalifikować ten proces fermentacyjny do grupy II klasyfikacji Gadena.

2). Z wykresu oraz obliczeń wynika, iż aktywność enzymu dekstranazy produkowanego przez Penicillium funiculosum jest duża dopiero w trakcie lizy komórek, enzym zostaje wtedy uwalniany z komórek. Tworzenie produktu nie jest związane ze wzrostem, ma miejsce tylko w komórkach nie namnażających się. Rozpatrywany proces fermentacyjny należy do grupy III klasyfikacji Gadena.

Różnice w wynikach poszczególnych grup wynikają z błędów w wykonaniu ćwiczenia, w tym błędów w rozcieńczeniach, miareczkowaniu itp.