Sprawozdanie nr 3

Część teoretyczna.

1. Budowa ściany komórkowej komórki bakteryjnej.

Ściana komórkowa pokryta jest otoczką, którą stanowią substancje śluzowe. Zbudowane są z polimerów cukrów, aminocukrów lub kwasów uronowych, przy czym ich skład chemiczny jest zawsze taki sam u bakterii należących do tego samego szczepu. Otoczki są dobrym antygenem, indukującym wytwarzanie swoistych przeciwciał, które biorą udział w niszczeniu bakterii. Chronią one bakterie przed wysychaniem, zwiększają ich chorobotwórczość oraz uczestniczą w przyczepianiu się bakterii do powierzchni (adhezja).

Ściana jest sztywna, porowata, nadaje kształt komórce bakteryjnej oraz stanowi warstwę ochronną. Składa się z peptydoglikanu (mureiny)-cząsteczki zbudowanej z łańcuchów polisacharydowych, które są połączone w sieci mostkami peptydowymi. Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej bakterie można podzielić na dwie grupy: Gram(-) i Gram(+).

W ścianie komórkowej bakterii Gram-dodatnich mureina stanowi 30-70% suchej masy. Składa się ona z około 40 warstw i stanowi sztywną część ściany komórkowej. Na zewnątrz znajduje się cienka, polisacharydowa warstwa plastyczna, z wiązaniami kowalencyjnymi, w której występują kwasy tejchojowe ( u niektórych bakterii Gram(+) występują kwasy teichouronowe i lipotejchojowe- są obecne osobno lub z kwasami tejchojowymi). Ściane komórkową u bakterii Gram-dodatnich można usunąć za pomocą lizozymu-enzymu występującego we łzach, śluzie jamy nosowej i białku jajka. W wyniku działania muroendopeptydaz (enzymów występujących głównie u bakterii) i antybiotyków β-laktamowych (np.penicyliny) następuje zniszczenie mostków peptydowych mureiny. Komórki bakterii Gram(+), niezależnie od ich pierwotnej formy, przyjmują kształt kulisty i noszą nazwę protoplastu.

Dominującą część ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych stanowi warstwa plastyczna, którą tworzy błona zewnętrzna, zbudowana z fosfolipidów, białek, lipoproteidu Brauna, lipo polisacharydu oraz antygenu wspólnego. W ścianie komórkowej bakterii Gram(-) występuje od jednej do trzech warstw peptydoglikanu ( stanowi on 4-10% suchej masy ściany komórkowej), który oddziela od warstwy plastycznej tzw. przestrzeń pery plazmatyczną. Warstwa lipoplisacharydowa jest inkrustowana jonami wapnia , które nadają jej dużą stabilność, dzięki czemu bakterie Gram-ujemne są oporne na działanie lizozymu. Związki he latujące, np. EDTA, zaburzają czynność nieprzepuszczalności błony dla antybiotyków i detergentów. W tej sytuacji ściana komórkowa bakterii Gram(-) staje się wrażliwa na ich działanie, ale nie ulega całkowitemu zniszczeniu. W efekcie powstają sferoplasty z fragmentami ściany komórkowej, które umieszczone w optymalnych warunkach środowiskowych mogą odbudowywać brakujące elementy.

2.Przetrwalniki – endospory.

Z reguły są wytwarzane przez bakterie Gram-dodatnie. Najlepiej są poznane u form cylindrycznych (Bacillus, Clostridium). Tworzą się w niekorzystnych warunkach środowiska. Najbardziej na zewnątrz znajduje się egzosporium(okrywa zbudowana z białka), pod nią płaszcz (złożony z warstw białek swoistych dla endospory), następnie korteks(luźno usieciowany peptydoglikan), otaczający też rdzeń spory(zwany też protoplastem spory). Rdzeń zawiera ścianę, błonę cytoplazmatyczną, nukleoid, itd. Kwas dipikoloinowy (DPA) i połączone z nim jony wapnia mogą stanowić do 10% suchej masy małej spory. Rdzeń jest silnie odwodniony. W dojrzałej endosporze rdzeń zawiera 10-30% wody zawartej w komórce wegetatywnej. Występują w nim wytworzone w czasie sporulacji swoiste białka rdzenia zwane małymi białkami sporowymi rozpuszczalnymi w kwasach. Wiążą się ściśle z DNA i chronią go przed uszkodzeniami przed UV, wysychaniem i wysoką temperaturą. W czasie kiełkowania służą jako źródło węgla i energii nowej wegetatywnej komórce, powstającej z endospory. Przetrwalniki powstają przez obudowanie genoforu (wraz z pewną ilością cytoplazmy, błoną komórkową i rybosomami) wielowarstwową ścianką.

Endospory są odporne na wysoką i niską temperaturę, wysychanie, promienie UV, niekorzystne pH itd. W stanie życia utajonego (anabiozy) mogą przebywać wiele lat, a z chwilą poprawy warunków z przetrwalnika odbudowana zostaje nowa komórka.

Ich położenie w komórce może być różne i jest cechą diagnostyczną. Mogą one występować w komórkach centralnie-w środku, bez lub z deformacją komórki, terminalnie-na biegunie,bez lub z deformacja komórki. Proces tworzenia się przetrwalników nosi nazwę sporulacji, która przebiega w kilku etapach:

*odwonienie i zagęszczenie się cytoplazmy wokół nukleoidu,

*tworzenie się błony cytoplazmatycznej i warstwy peptydoglikanowej, wielu osłon, które ściśle otaczają tworzący się przetrwalnik,

*ustanie procesów metabolicznych w przetrwalniku, przekształcenie się materiałów w kwas dwupikolinowy, który wraz z Ca²⁺, nadaje komórce ciepłooporność,

*uwolnienie się przetrwalnika z komórki,

*przejście przetrwalnika w stan anabiozy (uśpienia),

*germinacja-kiełkowanie przetrwalnika w komórkę wegetatywną w korzystnych warunkach środowiska.

1-endospora położona centralnie nie deformująca komórki,

2-endospora terminalna nie deformująca komórki,

3-endospora centralna, powodująca buławkowate rozdęcie komórki,

4-endospora położona centralnie, powodująca wrzecionowate rozdęcie komórki (postać clostridium),

5-spora terminalna kulista powodująca buławkowate rozdęcie komórki (postać plestridium),

6-spora w położeniu bocznym powodująca jednostronne wrzecionowate rozdęcie komórki.

3.Barwienie metodą Grama

Metoda barwienia bakterii wprowadzona w 1884 r. przez duńskiego lekarza Hansa Grama.
Metoda Grama polega na barwieniu fioletem krystalicznym, bejcowaniu jodem, odbarwianiu alkoholem i podbarwianiu fuksyną wodną, co pozwala na podział bakterii na dwie grupy: takie które zatrzymują odcienie barwnika podstawowego - bakterie Gram-dodatnie i takie które podbarwiają się barwnikiem kontrastowym - bakterie Gram-ujemne.

Różnice w sposobie barwienia bakterii wynikają ze składu i budowy ich ściany komórkowej. Barwnik podstawowy tworzy z jodem kompleksy na tyle duże, że nie mogą być wymyte ze ścian bakterii gramdodatnich - grubszych i bogatszych w peptydoglikan. Komórki te, nawet po przepłukaniu alkoholem, pozostają zabarwiane na niebiesko, a po dodaniu barwnika pomocniczego przybierają barwę fioletową. Przepłukane alkoholem bakterie gramujemne ulegają odbarwieniu i uwidaczniają się dopiero dzięki obecności dodatkowego barwnika o barwie różowej.

Część doświadczalna.

Ćwiczenie I - Barwienie ścian komórkowych metodą Webba – Sarcilla:

1. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym z hodowli bakterii na skosie agarowym wykonać w kropli wody jałowej rozmaz.

2. Wysuszyć na powietrzu, nie utrwalać.

3. Preparat umieścić w 5% roztworze kwasu taninowego na 30-60 minut w komorze wilgotnej,

4. Spłukać wodą, nie suszyć.

5. Barwić 0,5 % roztworem fioletu krystalicznego-2 minuty.

6. Spłukać wodą, nie suszyć.

7. Barwić 2-3 minuty roztworem czerwieni Kongo.

8. Przemyć wodą, wysuszyć, obserwować w mikroskopie pod immersją.

Wyniki barwienia : ściany komórkowe – fioletowe,

Cytoplazma – czerwona.

Ćwiczenie II – Barwienie przetrwalników (endospor) metodą Bartholomewa i Mittwera ‘’na zimno” – Bacillus:

1. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym z hodowli bakterii na skosie agarowym wykonać w kropli wody jałowej rozmaz.

2. Utrwalamy w płomieniu palnika ok. 20 razy.

3. Preparat barwić nasyconym roztworem zieleni malachitowej przez 10 minut.

4. Spłukać wodą bieżącą w ciągu 10 sekund.

5. Odbarwić roztworem safraniny.

6. Spłukać, osuszyć i obserwować.

Wynik barwienia: przetrwalniki – zielone,

Bakterie – żółte.

Doświaczenie III – Technika barwienia Gram – Sarcilla(ziarniak, Gram(+)), E.coli(pałeczka, Gram(-)):

1. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym z hodowli bakterii na skosie agarowym wykonać w kropli wody jałowej rozmaz.

2. Preparat barwić roztworem fioletu krystalicznego: 2-4 minuty.

3. Spłukać wodą.

4. Utrwalić płynem Lugola ( roztworem jodku w jodku potasu): 1,5-2 minuty.

5. Spłukać wodą.

6. Odbarwić etanolem (90% etanol z dodatkiem acetonu): 30 sekund.

7. Spłukać wodą.

8. Dobarwić kontrastowo (fuksyną karbolową lub safraniną) : 20 sekund.

9. Spłukać wodą, nie suszyć.

10. Osuszyć bibułą.

11. Oglądać pod immersją.