Każda cząsteczka ma charakterystyczny dla siebie układ poziomów energetycznych- elektronowych, oscylacyjnych i rotacyjnych, przy czym tych ostatnich nie obserwuje się w cieczach. W wyniku absorpcji promieniowania ultrafioletowego(UV) lub promieniowania widzialnego(VIS) - o energii odpowiadającej odległości między stanami energetycznymi w cząsteczce – cząsteczka będąca w stanie podstawowym S₀ przechodzi do jednego ze stanów wzbudzonych, a następnie na różne sposoby może pozbyć się nadmiaru energii. Możliwe przemiany energetyczne cząsteczek, powstałe na wskutek oddziaływania z promieniowaniem UV lub VIS przedstawia się często schematycznie na tzw. diagramie Jabłońskiego:

Oznaczenia:

A – absorpcja

F – fluorescencja

P –fosforescencja

IC – konwersja wewnętrzna

ISC – przejścia międzysystemowe (interkombinacyjne)

S₀, S₁, S₂ - stany elektronowe singletowy podstawowy i dwa wzbudzone

T₁, T₂- stany wzbudzone trypletowe

Liczby 0, 1, 2, 3 numerują poziomy oscylacyjne, strzałki z liniami ciągłymi oznaczają przejścia promieniste natomiast strzałki z liniami przerywanymi - przejścia bezpromieniste. Dla przejrzystości rysunku pominięto poziomy rotacyjne.

Należy przy tym pamiętać, że przejście cząsteczki ze stanu podstawowego do wzbudzonego S₁ może towarzyszyć zmiana szeregu jej właściwości fizycznych takich jak np. moment dipolowy, geometria cząsteczki, zdolność przyłączania czy odłączania protonu (właściwości kwasowo-zasadowe) itp. Skutkiem tego w stanie S₁ może zachodzić szereg procesów wtórnych, które rzutują na właściwości emisyjne związku. Warunkiem obserwowania tych procesów jest ich szybka kinetyka, co najmniej porównywalna z czasem życia stanu S₁(10⁻⁷ − 10⁻⁹s). Prawdopodobieństwo danego przejścia na poziomach energetycznych cząsteczki, uwarunkowane jest tzw. reguła wyboru. Zgodnie z tą regułą wzbronione są:

• wszystkie przejścia związane ze zmianą spinu elektronu np. w SO₂ pasmo przy 360nm związane z przejściem n − π.

• symetria rozkładu gęstości elektronowej stanu podstawowego i wzbudzonego jest taka sama np. jeżeli elektrony n znajdują się na czystym orbitalu p to przejście n − π jest wzbronione ze względu na symetrię lokalną. Zjawisko to występuje w związkach zawierających grupy nienasycone takie jak: C = O, C = S, N = N, N = O.

Wyznaczanie widm absorpcji danego związku opiera się na głównym prawie fotochemii – prawie Lamberta Beera:

• w postaci różniczkowej

$$- \frac{\text{dI}}{\text{ds}} = k \times c \times l$$

gdzie:

I - natężenie promieniowania elektromagnetycznego

s - grubość warstwy[cm]

k – stała proporcjonalności

• w postaci całkowej

$$\log\frac{I_{0}}{I} = A = \varepsilon \times c \times l$$

gdzie:

A - absorbancja

I₀ – początkowe natężenie promieniowania elektromagnetycznego

I – końcowe natężenie promieniowania elektromagnetycznego

ε - molowy współczynnik absorpcji$\left\lbrack \frac{dm^{3}}{mol \times cm} \right\rbrack$

s – stężenie substancji absorbującej$\lbrack\frac{\text{mol}}{dm^{3}}\rbrack$

l – grubość warstwy[cm]

Widmo absorpcyjne jest graficznym zapisem zmian wartości absorbancja w zależności od długości fali. Powstaje podczas przechodzenia promieniowania elektromagnetycznego przez ośrodek absorbujący promieniowanie. Widmo absorpcyjne związane jest ze zmianą energii elektronowej, oscylacyjnej i rotacyjnej. Widma absorpcji maja kształt krzywych Gaussa pod warunkiem, że absorbancja przedstawiona jest jaka funkcja wielkości wyrażonej w jednostkach proporcjonalnych do energii. Położenie maksimum absorpcji odpowiada energii przejścia elektronowego i charakteryzuje dane przejście. Nie ma jednak prostej zależności pomiędzy położeniem pasma a typem przejścia elektronowego. Molowy współczynnik absorpcji pasma charakteryzuje prawdopodobieństwo danego przejścia elektronowego. Charakterystyczną właściwością absorbancji jest jej addytywność. Oznacza to, że w przypadku mieszaniny substancji absorbującej promieniowanie elektromagnetyczne absorbancja jest równa sumie absorbancji poszczególnych jej składników. W temperaturze pokojowej absorpcja zachodzi praktycznie z zerowego poziomu oscylacyjnego stanu podstawowego, na dowolny poziom oscylacyjny stanu wzbudzonego, natomiast emisja zachodzi tylko z zerowego poziomu oscylacyjnego pierwszego stanu wzbudzonego na dowolny poziom oscylacyjny stany podstawowego. Poprzez porównanie widma adsorpcyjnych i widm fluorescencyjnych danej substancji możemy wyznaczyć energię pierwszego wzbudzenia stanu singletowego S₁, gdyż energia przejść 0 − 0 jest jednakowa w przypadku adsorpcji i emisji i dlatego ich pasma będą się nakładać na wykresie.

W cieczach w temperaturach bliskich temperaturze pokojowej obserwuje się praktycznie tylko fluorescencję(przejście promieniste pomiędzy stanami o tej samej multipletowości). Widmo jej składa się z szeregu pasm oscylacyjno-elektronowych, a jego kształt zdeterminowany jest regułą Francka-Condona, która mówi, że w czasie aktu absorpcji kwantu promieniowania elektromagnetycznego (10⁻¹⁵s), jądra atomowe w molekule nie zmieniają w sposób istotny swego położenia i modu oscylacji. Zatem w stanie wzbudzonym natychmiast po akcie absorpcji konfiguracja i wzajemne ruchy jąder atomowych są identyczne jak w stanie podstawowym tuż przed absorpcją. Czas życia w elektronowym stanie wzbudzonym jest rzędu (10⁻⁴ − 10⁻⁹s). W tym czasie molekuła oddaje w sposób bezpromienisty w zderzeniach nadmiar energii rotacyjnej i oscylacyjnej. Energia wzbudzenia elektronowego jest zbyt duża, aby molekuła mogła się jej łatwo pozbyć bezpromieniście w niewysokich temperaturach. Dominuje więc mechanizm promienisty. Emisja następuje więc z zerowego poziomu oscylacyjnego stanu wzbudzonego, a zatem widmo emisyjne jest przesunięte w stronę większych długości fali w stosunku do widma absorpcji (przesunięcie Stokesa). Jeżeli układ poziomów oscylacyjnych w stanach podstawowym i wzbudzonym S1 jest podobny, to widmo emisji fluorescencji jest zwierciadlanym odbiciem długofalowego pasma w widmie absorpcji. Natężenie fluorescencji F jest proporcjonalne do natężenia światła zaabsorbowanego przez próbkę oraz do wydajności kwantowej badanej cząsteczki.

Aby uzyskać pełną charakterystykę widm fluorescencji zbiera się dwa rodzaje widm:

• widmo emisyjne – monochromator wzbudzający ustawiony jest na określoną długość fali absorbowaną przez próbkę, natomiast monochromator emisyjny „przemiata” i analizuje emitowane światło (λ_wzb = constant, λ_em = zmienia sie)

• widmo wzbudzenia(ekscytacyjne) – monochromator emisyjny ustawiony jest na określoną długość fali w zakresie fluorescencji, natomiast monochromator wzbudzający „przemiata” długość fali promieniowania wzbudzającego (λ_em = constant, λ_wzb = zmienia sie)

Poniżej zamieszczono schemat budowy typowego spektrofluorymetru oraz zestaw widm (widmo wzbudzenia, fosforescencji i fluorescencji) otrzymanych dla antracenu: