Oznaczanie obecności pałeczek Campylobacter spp. w żywności
Charakterystyka ogólna drobnoustrojów
RzÄ…d: Campylobacterales
Rodzina: Campylobacteriaceae
Rodzaj: Campylobacter
Bakterie znane od 1886 roku, dawniej klasyfikowane jako rodzaj Vibrio
Cienkie, zakrzywione (seagull wing, corkscrew), gram-ujemne pałeczki, niewytwarzające przetrwalników
Pojedyncza rzęska, uni- lub bipolarnie, więc zdolność do ruchu. W świeżych preparatach wysoce ruchliwe, ruch skokowy (mikroskop z ciemnym polem widzenia lub kontrastowo- fazowy)
Charakterystyka ogólna drobnoustrojów
Bakterie termofilne i mikroaerofilne
Optymalny wzrost w atmosferze o zredukowanej zawartości tlenu, w temp. 42˚C (war. panujące w pp. ptaków!)
Brak wzrostu w temperaturze pokojowej
Wrażliwość na czynniki środowiska (wysychanie, pH) znacznie większa niż Salmonella spp. lub E.coli.
Powolne namnażanie- okres inkubacji podłoży: 48- 72h!
Trudna hodowla drobnoustroju- wymaga podłoży wzbogaconych, z dodatkiem czynników selektywnych (antybiotyki), aparatów do inkubacji posiewów w atm. mikroaerofilnej (anaerostatów)
Więc rzeczywista liczba przypadków zatruć na tle Campylobacter spp. znacznie niedoszacowana!
Skład gazowy
Powietrze atmosferyczne
azot 78,08%
tlen 20,94%
argon 0,93%
dwutlenek węgla 0,038%
Atmosfera mikroaerofilna
dwutlenek węgla 10+/-3%
tlen 5 +/-2%
azot – uzupełnienie do stanu równowagi
Charakterystyka ogólna drobnoustroju
W obrębie rodzaju zidentyfikowano 24 gatunki i wiele podgatunków
Patogenne dla człowieka są:
C. jejuni subspecies jejuni
Campylobacter coli
C. jejuni subspecies doylei
Campylobacter lari
C. fetus subspecies fetus
Campylobacter hyointestinalis
Campylobacter conciscus
Rezerwuary Campylobacter spp.
Drób- zakażenia Campylobacter spp.
W zakażeniach ptaków dominują C.jejuni i C.coli
Infekcja u drobiu najczęściej przebiega bezobjawowo.
U młodych osobników możliwe stany zapalne jelit (enteritis) i biegunki
Często jedynie obniżenie produkcyjności stada
Rezerwuary Campylobacter spp.
Pozostałe gatunki ptaków:
wróble i jaskółki- najwyższy procent nosicielstwa: od 50-100%
wrony do 89%
gołębie miejskie do 60%
mewy ok. 50%
Rezerwuary Campylobacter spp.
Campylobacter spp. może także kolonizować przewód pokarmowy wielu innych gatunków zwierząt:
Bydło: C. jejuni i C. hyointestinalis oraz C.fetus subsp. veneralis (choroba mętwikowa)
Owce: C.fetus subspecies fetus (enzootyczne ronienia owiec)
Trzoda chlewna: C.coli, rzadziej C.lari i C.upsaliensis; C. mucosalis i C.hyointestinalis są składnikami normalnej flory jelitowej
Rezerwuary Campylobacter spp.
Wysokie nosicielstwo wśród zwierząt towarzyszących!
Koty- prewalencja do 92%, dominuje C.helveticus
Psy- do 76% zakażonych, dominuje C.upsaliensis
Kliniczne objawy zakażenia u kociąt i szczeniąt (biegunka); zarazki przez cały okres trwania choroby wydalane są wraz z kałem do otoczenia
Zwierzęta te mogą być źródłem zakażenia zwłaszcza dla dzieci (brak dostatecznej higieny, np. po zabawie z pupilami)
Czynniki zjadliwości zarazka:
Ruchliwość i chemotaksja (mutanty pozbawione tych cech nie były w stanie kolonizować enterocytów)
Adhezja i inwazyjność (dochodzi do reakcji pomiędzy adhezynami na powierzchni komórki bakteryjnej a receptorami na powierzchni komórek eukariotycznych gospodarza)
Zdolność do produkcji enterotoksyn i cytotoksyn
Po dostaniu się do jelita większość szczepów Campylobacter spp. przedostaje się przez warstwę śluzu, przyczepia się do komórek nabłonka jelitowego i do nich wnika.
Funkcję adhezyn spełniają białka rzęski, białka błony zewnętrznej oraz glikolipidy.. Białka błony zewnętrznej, (np. CadF- białko wiążące fibronektynę) umożliwiają proces internalizacji komórki bakteryjnej.
reszty cukrowe glikolipidów i glikoprotein biorą udział w stymulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza.
Campylobacter spp.
aspekt epidemiologiczny
Epidemie pokarmowe u ludzi
Co roku Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA- European Food Safety Authority www.efsa.europa.eu) publikuje raport dot. występowania zoonoz u ludzi
Raport opiera się o dane przekazywane przez państwa członkowski EU
Istotną częścią tego opracowania jest informacja dot. występowania zatruć pokarmowych u ludzi o charakterze epidemicznym, wywoływanych przez chorobotwórcze bakterie, wirusy i pasożyty
Raport zawiera informacje nt liczby epidemii pokarmowych, ich oznaczonych/potencjalnych źródeł w postaci żywności oraz dróg zakażeń człowieka
Epidemie pokarmowe u ludzi
Epidemia pokarmowa (food- borne outbreak )
to epidemia, której źródłem jest żywność; zachorowania obejmują dwa lub więcej przypadków, a ich wystąpienie jest związane lub prawdopodobnie związane z tym samym źródłem zakażenia.
Epidemie pokarmowe u ludzi
Zatrucia na tle termofilnych pałeczek Campylobacter spp.- na III miejscu po Salmonelli i odżywnościowych zakażeniach wirusowych!
liczba przypadków systematycznie wzrasta (coraz lepsza diagnostyka?)
488 epidemii pokarmowych w Europie w 2008 roku
W latach 2005-2008 kampylobakterioza była najczęściej występującą chorobą odzwierzęcą u ludzi, z łączną liczbą przypadków zachorowań w Europie wynoszącą 201. 678 osób (dane EFSA)
Camylobacter spp. –żywność zagrożona
mięso drobiowe i jego produkty (niepoddane odpowiedniej obróbce termicznej)
skóra drobiu po uboju wilgotna, pokryta śluzem; zarazki te izolowane są nawet ze 100% tuszek, w 1g skóry drobiu po uboju nawet 100- 10000tyś pałeczek)
mleko i przetwory mleczne (zwłaszcza mleko niepasteryzowane! Pasteryzacja łatwo niszczy zarazek)
Camylobacter spp. –żywność zagrożona
Owoce oraz warzywa- pola nawożone obornikiem i gnojowicą
Niedogotowane mięso wieprzowe, wołowe, dziczyzna, baranina, podroby
Jaja
Owoce morza (ostrygi, małże)
Woda
Jakiekolwiek inne pokarmy zanieczyszczone poprzez kontakt z surowym mięsem drobiowym
Zatrucia ludzi- przebieg i objawy
To toksykoinfekcja pokarmowa
Dawka infekcyjna- niska! wystarczy 500 bakterii!
Do zakażeń ludzi dochodzi relatywnie łatwo i często
Okres inkubacji: 2- 5 dni od spożycia zakażonej żywności
Zatrucia ludzi- przebieg i objawy
Zwykle postać zapalenia żołądka i jelit lub zapalenia jelit (gastroenteritis/enteritis)
Najczęściej biegunka, często krwawa, połączona z bólem brzucha i gorączką
Ponadto nudności, wymioty, ogólne osłabienie
Samowyleczenie w ciÄ…gu 3- 6 dni
Uogólnione zakażenie- bardzo rzadko
U dzieci objawy mogą sugerować zapalenie wyrostka robaczkowego
Lek z wyboru: azytromycyna lub erytromycyna (makrolidy)
Zatrucia ludzi- przebieg i objawy
Zatrucie może mieć groźny przebieg w przypadku osób w złym stanie ogólnym, chorych na raka, zakażonych HIV, diabetyków i ludzi starszych
W USA każdego roku z powodu kampylobakteriozy notuje się ok. 1000 zgonów (Consumers Union, 1998)
Zatrucia ludzi- przebieg i objawy
Późne konsekwencje zakażenia pałeczkami Campylobacter spp.
Jak zapobiegać zatruciom?
Jak zapobiegać zatruciom?
Przestrzeganie zasad higieny podczas przygotowywania, podawania posiłków oraz przechowywania żywności; dotyczy to w szczególności potraw z drobiu
Wystarczająco długa obróbka cieplna dań z drobiu (sok wypływający z nakłutego mięsa winien być klarowny)
Wydzielenie osobnych desek i tacek używanych tylko do przygotowywania potraw z drobiu (aby nie doszło do ew. zakażenia krzyżowego pozostałych dań, zwłaszcza tych, które nie będą już poddawane obróbce termicznej)
Jak zapobiegać zatruciom?
Dokładne mycie rąk
przed przystąpieniem do przygotowywania posiłków, w trakcie i po zakończeniu prac kuchennych
po kontakcie z osobÄ… wykazujÄ…cÄ… objawy zatrucia pokarmowego
po zabawie ze zwierzętami domowymi
Jak najszybsze schładzanie potraw (do dwóch godzin po przyrządzeniu)
Rozmrażanie drobiu w lodówce, nie w temperaturze pokojowej (zwróć uwagę aby sok nie skapywał na produkty na niższych półkach); gdy nie ma wystarczająco dużo czasu- należy użyć mikrofalówki
Jak zapobiegać zatruciom?
PN-EN ISO 102727-1
Mikrobiologia żywności i pasz
Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp.
Metoda ta ma zastosowanie do badania żywności i pasz oraz próbek środowiskowych z obszaru produkcji żywności i obrotu żywnością
Wykrywanie obecności bakterii z rodzaju Campylobacter wymaga wykonania następujących etapów badań:
Namnażanie na selektywnej pożywce płynnej
Izolowanie i wybór do potwierdzeń
Potwierdzenie
Pobieranie próbek
Próbka powinna być w pełni reprezentatywna, nie może ulec uszkodzeniu ani zmianie podczas transportu lub przechowywania
Bakterie z rodzaju Campylobacter są wrażliwe na mrożenie, ale stosunkowo dobrze przeżywają w warunkach chłodniczych, stąd niewskazane jest stosowanie mrożenia, zaleca się przechowywanie próbek w temp. +3˚C +/- 2C
Próbki należy poddać badaniom tak szybko, jak to możliwe; należy chronić je przed wysuszeniem
Wielkość naważki, zawiesina wyjściowa i rozcieńczenia
Aby przygotować wyjściowa zawiesinę należy zmieszać określona ilość próbki (masa lub objętość) z dziewięciokrotna objętością płynnej pożywki namnażającej bulion Boltona, żeby otrzymać dziesięciokrotne rozcieńczenie próbki.
1.Namnażanie
Bulion Boltona- płynna pożywka namnażająca
Inkubacja w warunkach mikroaerofilnych
37˚C przez 4-6h, a następnie w 42˚C przez 44 +/- 4 h
2. Izolowanie
Hodowlę z pożywki namnażającej przesiewamy na dwie różne selektywne pożywki agarowe:
agar CCDA (charcoal cefoperazone deoxycholate agar)
pożywkę agarową różniącą się zasadniczo od CCDA, do wyboru: Agar Skirrow, Agar Karmali , Agar Prestona
Inkubacja w atm. mikroaerofilnej, w 41,5C, 44h
Po tym czasie sprawdzić obecność typowych/ podejrzanych kolonii Campylobacter na płytkach
CCDA Agar
Typowe kolonie są szarawe, często z metalicznym połyskiem, płaskie i wilgotne, z tendencją do rozlewającego wzrostu
3. Potwierdzanie gatunków
Campylobacter spp.
Bakterie zachowują żywotność jedynie w atm. mikroaerofilnej, więc wszystkie czynności należy wykonywać możliwie szybko!
Do badań wybieramy 1 podejrzaną/ typową kolonię; gdy wynik ujemny- pobieramy kolejne 4 kolonie
Przesiew wybranej kolonii na pożywkę agarową Columbia z krwią
3. Potwierdzanie gatunków
Campylobacter spp.
Ocena cech morfologicznych i zdolności do ruchu pod mikroskopem
Ocena zdolności do wzrostu w temp. 25˚C w atm. mikroaerofilnej na pożywce Columbia z krwią
Ocena zdolności do wzrostu w temp. 41,˚5C w atm. tlenowej na pożywce Columbia z krwią
3. Potwierdzanie gatunków
Campylobacter spp.
Wykrywanie oksydazy- część wybranej charakterystycznej kolonii rozetrzeć na bibule fitracyjnej nasączonej odczynnikiem na oksydazę
Reakcja dodatnia, gdy w ciÄ…gu 10s fioletowe lub ciemnoniebieskie zabarwienie
3. Potwierdzanie gatunków
Campylobacter spp.
Charakterystyka Campylobacter spp.
4. Identyfikacja gatunkowa
(nieobligatoryjna)
wykrywanie katalazy
określanie wrażliwości na kwas nalidyksowy i cefalotynę
wykrywanie zdolności hydrolizy hipuranu
wykrywanie zdolności hydrolizy octanu indoksylu