SPRAWOZDANIE

„Biochemiczne właściwości bakterii”

Data wykonania ćwiczenia :

• posiew : 27.03.2014

• odczyt : 03.04.2014

Grupa CH, czwartek godz. 10:15

Sekcja druga w składzie :

CZEMERAJDA Agata

POTRZEBOWSKA Natalia

SERAFIMOWICZ Weronika

Wstęp teoretyczny:

Świat organizmów żywych bogaty jest w różnorodne mikroorganizmy. Aby móc je zidentyfikować stosuje się różne metody takie jak PCR (Polymerase Chain Reaction), testy Api,
czy szeregi biochemiczne. Można wtedy określić cechy morfologiczne, fizjologiczne i biochemiczne. Metody klasyczne, jakkolwiek pracochłonne i czasochłonne, mogą być stosowane w każdym laboratorium mikrobiologicznym o standardowym wyposażeniu.

Właściwości metaboliczne mikroorganizmów określa się głównie na podstawie prowadzonych przez nie reakcji katabolicznych, czyli procesów rozkładu określonych związków chemicznych przez enzymy bakteryjne w tzw. szeregach biochemicznych. Są to zestawy podłoży,
na które posiewa się badane drobnoustroje, sprawdzając łącznie ich cechy glikolityczne (sacharolityczne, rozkład węglowodanów), proteolityczne (rozkład białek, peptydów oraz aminokwasów), lipolityczne (rozkład lipidów i kwasów tłuszczowych), utleniająco-redukcyjne.

Po okresie inkubacji wykonuje się próby identyfikacyjne polegające na wykrywaniu produktów reakcji chemicznych katalizowanych przez enzymy drobnoustrojów, określeniu zmian pH środowiska wzrostu hodowli za pomocą indykatorów (wskaźników), ewentualnie badanie sposobu wykorzystania związków chemicznych będących dla bakterii źródłami węgla, energii lub azotu.

Istnieje duża grupa mikroorganizmów, która posiadają zdolność rozkładu związku będącego produktem przemiany materii białek zwierzęcych, czyli mocznika. Rozkład mocznika
jest przeprowadzany przez ureazę - enzym, który katalizuje reakcję rozkładu mocznika do amoniaku (nieorganiczny związek azotu) i dwutlenku węgla. Bakterie mocznikowe to głównie bakterie tlenowe, które często występują w wodach zanieczyszczonych i bytowych. Przedstawicielem jest Sporosarcina ureae.

Proces redukcji jonów azotanowych (V), przeprowadzany m.in. przez bakterie jelitowe,
to amonifikacja azotanów. Zachodzi on w warunkach beztlenowych, gdy bakterie wykorzystują azotany (V) jako zewnątrzkomórkowy akceptor elektronów, przekształcając go najpierw do azotanu (III), a potem do amoniaku bez uwolnienia azotu cząsteczkowego.

Bakterie anaerobowe są zdolne do przeprowadzenia redukcji siarczanów (oddychanie beztlenowe), które jako donory wykorzystują związki organiczne i wodór. Siarczany są redukowane przez bakterie do siarczków lub siarkowodoru w warunkach beztlenowych. Siarczan jest ostatecznym akceptorem elektronów.

Katalaza to enzym, katalizujący rozkład nadtlenku wodoru znajdującego się w wodzie utlenionej na wodę i tlen. Znaczne jej ilości występują w komórkach zwierzęcych np. w wątrobie, nerce, leukocytach i erytrocytach, bakteriach tlenowych i peroksysomach komórek roślinnych fotosyntetyzujących. Enzym ten jest bardzo aktywny, co przyspiesza katalizę nadtlenku wodoru.

Źródła : www.google.pl , Skrypt „Laboratorium mikrobiologiczne. Wybrane ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i stosowanej” A. Ziembińska, Anna Węgrzyn.

Cel ćwiczenia:

Zbadanie biochemicznych właściwości czystych szczepów bakteryjnych (właściwości amonifikacyjne i proteolityczne, produkcja katalazy, redukcja siarczanów, usuwanie mocznika)

Metodyka:

• do wykonania ćwiczenia otrzymano niezidentyfikowany szczep bakterii

• materiał bakteriologiczny zawieszono w 9 ml soli fizjologicznej

1. Właściwości amonifikacyjne i proteolityczne, redukcja siarczanów, usuwanie mocznika:

• wykonano posiewy metodą wgłębną poprzez wprowadzenie po 1 ml zawiesiny bakteryjnej do trzech różnych płynnych podłoży:

- mocznikowego Tidwella, Heathera i Merkle,

- na redukcję siarczanów Boarsa,

- do wody peptonowej

• w probówce z wodą peptonową umieszczono również pasek ołowiowy

• probówki poddano siedmiodniowej inkubacji w temperaturze pokojowej, po której nastąpił odczyt

1. Wykrywanie katalazy:

• materiał bakteriologiczny zawieszono w kropli 3% wody utlenionej na szkiełku podstawowym i poddano obserwacji, wyniki zanotowano

1. Próba Nesslera:

• po tygodniowej inkubacji z probówki z wodą peptonową pobrano 0,2 ml zawiesiny, które umieszczono we wgłębieniu porcelanowej płytki, a następnie dodano 0,2 ml odczynnika Nesslera

• próbka została poddana obserwacji, wyniki zanotowano

Wyniki:

1. Wyniki po 7 dniach inkubacji probówek w temperaturze pokojowej:

• Niezidentyfikowany szczep bakterii zawieszonych na podłożu mocznikowym Tidwella, Heathera i Merkle - została zaobserwowana zmiana koloru podłoża

z intensywnie różowego na bladoróżowy (Rys. 1.A)

• Niezidentyfikowany szczep bakterii na podłożu Boarsa - na dnie probówki

znajdował się biały, kłaczkowaty osad (Rys. 1.B)

• Niezidentyfikowany szczep bakterii w wodzie peptonowej - brak zmian w wodzie peptonowej (brak zmętnienia, kożuszka, osadu itp.) również na pasku ołowiowym nie wystąpiła zmiana koloru (Rys. 1.C)

Rys. 1 Właściwości bakterii: rozkład mocznika (A), redukcja siarczanów (B), właściwości amonifikacyjne i proteolityczne (C)

1. Badanie na obecność katalazy wykonywane było w dzień przeprowadzania ćwiczenia:

• Podczas wykrywania katalazy badanych bakterii na szkiełku podstawowym

po dodaniu kropli 3%-wej wody utlenionej zaobserwowano uwalnianie się pęcherzyków gazu (Rys. 2)

Rys. 2 Wykrywanie obecności katalazy u bakterii

1. Próba wykonywana w dzień odczytu, po tygodniowej inkubacji w temperaturze pokojowej:

• W trakcie próby Nesslera po dodaniu odczynnika do wody peptydowej (w której znajdują się niezidentyfikowane bakterie) pojawił się intensywnie żółty kolor (Rys. 3)

Rys. 3 Wykrywanie produkcji amoniaku przez bakterie

Wnioski:

• Zmiana koloru podłoża mocznikowego Tidwella, Heathera i Merkle z różowego na bladoróżowy jest oznaką pozytywnego przebiegu reakcji tzn. badane bakterie mają zdolność rozkładu mocznika. Jasnoróżowa barwa najprawdopodobniej powstała

na skutek zbyt długiego czasu inkubacji. Po paru dniach przypuszczalnie pojawił się kolor czerwony. Jednak przez kolejne dni tracił on swoją intensywność, dlatego w dniu odczytu wystąpił kolor bladoróżowy.

• Biały osad, który pojawił się na dnie probówki nie jest jednoznacznym wynikiem reakcji, ponieważ do stwierdzenia zdolności bakterii do redukcji siarczanów wymagany jest czarny kolor osadu wytrąconego w badanej próbce. Możemy zatem przypuszczać, że badane bakterie nie redukują siarczanów.

• Nieobecność jakichkolwiek zmian w wodzie peptonowej świadczy o braku właściwości proteolitycznych badanych bakterii. Na pasku ołowiowym także nie wystąpił oczekiwany, czarny kolor co świadczy o reakcji negatywnej (badane bakterie nie są zdolne do produkcji amoniaku).

• Podczas wykrywania katalazy w badanych bakteriach zaobserwowano uwalnianie się pęcherzyków gazu (pojawianie się bąbelków), co świadczy o dodatnim wyniku; obecności enzymów z grupy oksydoreduktaz katalizujących proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i tlenu.

• Podczas próby Nesslera przeprowadzonej we wgłębieniu porcelanowej płytki

po dodaniu odczynnika do wody peptydowej (w której znajdują się niezidentyfikowane bakterie) pojawił się intensywnie żółty kolor. Świadczy to o produkcji małej ilości amoniaku.