Biotechnologia

Grupa I

Poniedziałek 8:15 – 12:00

Lilianna Ożga, Ewa Świegocka, Martyna Kozłowska

LABORATORIUM Z BIOTECHNOLOGII

ĆWICZENIE NR 3

Biosynteza proteinaz bakteryjnych w fermentorach

1. Wstęp teoretyczny

Proteinazy stanowią grupę enzymów proteolitycznych, które katalizują hydrolizę wiązań peptydowych oraz estrowych. Proteinazy są nierozłącznie związane z całym życiem białek. Przetwarzanie białek przez proteinazy powoduje w rezultacie włączenie lub wyłączenie ich aktywności biologicznej. Biorąc za podstawę budowę centrum aktywnego można podzielić je na 4 grupy: serynowe, cysteinowe, aspartylowe i metaloproteinazy. Alkaliczne proteinazy pozakomórkowe, wytwarzane przez bakterie z rodzaju Bacillus (B.subtilis, B.pumilus, B.lichenformis, B.amyloliquefaciens) to proteinazy serynowe nazwywane subtilizyn. Oprócz pożytecznej funkcji proteolizy istnieją również związane z nią niebezpieczeństwa, więc procesy te muszą być ściśle kontrolowane w określonym czasie i miejscu, tak, aby były pożądane i skuteczne. Jednym z mechanizmów kontroli proteolitycznej jest działanie inhibitorów proteinaz, obecnych we wszystkich znanych organizmach oraz w różnych tkankach tych organizmów. Proteinazy znalazły obszerne zastosowanie w przemyśle:, piwowarskim (stabilizacja klarowności piwa), paszowym (dodatek do pasz dla bydła), mięsnym (proces dojrzewania mięsa wołowego). Stosuje je się także do: depilacji skór, oczyszczania ścieków z białka, produkcji środków piorących.

Drobnoustroje, które stosowane są do produkcji enzymów mogą być hodowane dwoma metodami:

• powierzchniową- na pożywkach stałych lub płynnych w cienkiej warstwie

• wgłębną w dużych zamkniętych fermentorach przy intensywnym napowietrzaniu i mieszaniu.

Fermentor (bioreaktor)- urządzenie skonstruowane w sposób umożliwiający kontrolę procesu produkcyjnego i jego optymalny przebieg (pomiar i regulację parametrów) w warunkach maksymalnego ograniczenia lub całkowitego wyeliminowania możliwości zakażeń; prowadzone są w nim: procesy mikrobiologiczne, enzymatyczne, jak również hodowle komórek organizmów wyższych; bardzo ważna jest (przy prowadzeniu procesów tlenowych) sprawność w zakresie wymiany masy (tlenu) oraz odprowadzania wydzielającego się ciepła. W warunkach laboratoryjnych stosuje się różne typy bioreaktorów o pojemności roboczej od kilku ml do kilkunastu litrów, natomiast w warunkach przemysłowych o pojemności od kilkudziesięciu litrów do kilkuset m³. Bardzo popularne są bioreaktory do procesów wgłębnych zapewniające dobre warunki mieszania i napowietrzania.

Przykładowa budowa fermentora:

• pojemność od 6 do 150 m³,

• zbudowany ze stali kwasoodpornej,

• posiada płaszcz grzejny (umożliwia chłodzenie i sterylizację pożywki pow. 100ºC),

• układ do pomiaru i regulacji temperatury,

• układ napowietrzająco – mieszający (mieszadło, bełkotka), mieszadła od dołu lub od góry zbiornika.

• układ do pomiaru i regulacji pH (elektrody)

• niektóre posiadają mechaniczne zbijacze piany,

• posiadają króciec wylotowy do poboru próbek pożywki,

• elektrody mierzące liczbę drobnoustrojów (kalibrujemy je przed każdą hodowlą).

Hodowla w fermentorze

Na początku należy umyć zbiornik, wysterylizować przed hodowlą, wykalibrować elektrody, przygotować sprzęt, wężyki, media sterylizowane w autoklawach, przygotować pokrywę ( ważne jest aby wiedzieć jaką ilość mediów będziemy dodawać, żeby odpowiednio przygotować określoną ilość otworów w pokrywie). Następnie umieszcza się pożywkę, dodaje do niej, jeśli to konieczne, specjalne (uzupełniające ) składniki, np. odpieniacz oraz doprowadza do odpowiedniego pH. Sterylizujemy w fermentorze w temperaturze 121^oC, pod ciśnieniem 1 atm przez określony czas. Po ochłodzeniu do temperatury hodowli, pH pożywki koryguje się do wskazanej wartości i wprowadzamy inokulum (10-20% objętości fermentora) -luzujemy króciec wlotowy, opalamy zwojem waty nasyconej spirytusem i otwieramy, opalamy szyjkę kolby z inokulum nad palnikiem, wlewamy inokulum do fermentora i natychmiast zamykamy króciec wlotowy (do dużych fermentorów produkcyjnych otrzymanie koniecznej ilości inokulum wymaga kilkuetapowego namnażania: probówka →kolba →mały fermentor (15dm³) →duży fermentor(3m³) →główny fermentor produkcyjny ). Podczas hodowli drobnoustrojów tlenowych konieczne jest mieszanie pożywki i ciągłe napowietrzanie przez przepuszczanie pod ciśnieniem sterylnego powietrza. Ilość powietrza, jego dyspersja (wymiary pęcherzyków) regulowana szybkością mieszania pożywki, stosowaniem specjalnych barboterów i przegród decydują często o efektywności całego procesu produkcyjnego. Intensywne napowietrzanie sprzyja pienieniu się pożywki. Fermentory wyposażone są w układ zapobiegający nadmiernemu powstawaniu piany (mechaniczne i chemiczne odpieniacze). Nadciśnienie powietrza lub innego gazu stosuje się w fermentorze by zapobiec przenikaniu do wnętrza niesterylnego powietrza i polepszyć efekty biosyntezy. Podczas prowadzenia hodowli mierzymy różne parametry: pO₂, pH, ilość enzymu, zmętnienie, ilość cukru zużywanego przez drobnoustroje, itp. Parametry te można zmieniać, np. zmienić pH dodając kwasu. W czasie procesu dostarczamy powietrze, niezbędny jest więc filtr wlotowy (aby nie dostało się nic, co by mogło zaszkodzić naszej hodowli). Dostarczane pęcherzyki powietrza (pod łopatkami mieszadła) rozbijają się o mieszadło na mniejsze pęcherzyki. Powstająca piana zaczyna wychodzić przez filtr wylotowy, zapycha go i mogą popękać rurki-dlatego konieczne jest stosowanie odpieniaczy. Można stosować odpieniacze chemiczne, które zmniejszają napięcie powierzchniowe cieczy; działają one na powierzchni cieczy, oraz mechaniczne mające postać dwóch stożków, które mają na swoim obwodzie płytki, piana jest zbijana, tworzy się ciecz, która zrasza pianę i ta jest zbijana. Przeważnie są montowane w górnej części fermentora. W fermentorach są czujniki, które informują o wysokim poziomie piany i zostaje uruchomiony wtedy mechaniczny odpieniacz. Jeśli on nie pomoże to zostaje uruchomiony chemiczny odpieniacz. Fermentor po określonym czasie hodowli opróżnia się ,ciecz pohodowlaną poddaje się pomiarom ilości drobnoustrojów i enzymów, fermentor czyści się i proces zaczyna się od nowa. Hodowlę należy oczyścić i zatężyć na specjalnych wyparkach.

Rys. nr 1. Schemat fermentora używanego w procesach biosyntezy.

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było poznanie ogólnych zasad prowadzenia hodowli drobnoustrojów w fermentorach oraz badania dynamiki nagromadzania produktu (np.enzymu) w podłożu hodowlanym na przykładzie proteinaz Bacillus subtilis.

1. Materiał biologiczny

Hodowla wgłębna bakterii Bacillus subtilis z IBT PŁ.

Skład podłoża:

mąka ziemniaczana 3,6%

laktoza 2%

ZnSO₄ x H₂O 0,002%

CaCl₂ 0,064%

namok kuk. 1,65%

kazeina 0,85%

HCl stęż. 0,5 ml

pH po sterylizacji 8,4.

1. Wykonanie ćwiczenia

4.1. Oznaczanie biomasy.

W celu oznaczenia biomasy dokonaliśmy pomiaru zmętnienia cieczy pohodowlanych (rozcieńczonych x20) przy długości fali λ=660 nm. Wyniki absorbancji zostały przemnożone przez rozcieńczenie.

Przykład obliczeniowy dla enzymu z probówki nr 1:

A₁ = 0,350; B = A*R(rozc.)

B₁ = 0,350*20 = 7.0

4.2. Oznaczenie aktywności proteolitycznej wg Ansona.

Zasada metody: Hemoglobina zdenaturowana mocznikiem (łatwiej ulega rozkładowi) w śr. zasadowym, trawiona enzymem proteolitycznym odszczepia produkty rozpuszczalne w kwasie TCA, wśród których zawartość tyrozyny i tryptofanu oznacza się fenolowym odczynnikiem Folina.

Odczynniki:

• 2% roztwór hemoglobiny, częściowo zdenaturowanej mocznikiem (o pH 10,2)

• 5% kwas TCA

• 0,6 n NaOH

• odczynnik Folina ( rozcieńczony 1:2)

Oznaczenia:

Próby badane: Do 8 probówek dodaliśmy po 1ml substratu hemoglobiny, a następnie po 0,2 ml enzymu (rozcieńczonego wodą dest. 20-krotnie i hodowanego w różnym czasie). Po wymieszaniu inkubowaliśmy je 10 minut w temperaturze pokojowej. Potem przerwaliśmy reakcję dodając 2 ml TCA do każdej z probówek. Całość pozostawiliśmy w temp. pokojowej na 30 minut.

Próby kontrolne: Do 8 probówek zawierających po 1 ml substratu (hemoglobiny) dodaliśmy po 2 ml TCA, a po dokładnym wymieszaniu po 0,2 ml enzymu (rozc. 20- krotne), każdy hodowany w innym czasie. Próbę inkubowaliśmy 30 minut w temp. pokojowej.

Po upływie 30 minut próby badane i kontrolne przefiltrowaliśmy przez sączki bibułowe, a w otrzymanym filtracie oznaczyliśmy zawartość tyrozyny. W tym celu pobraliśmy do probówek po 1 ml filtratu, dodaliśmy po 2 ml 0,6 N NaOH i 0,6 ml odczynnika Folina. Próby wymieszaliśmy i odstawiliśmy na ponad 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zmierzyliśmy absorbancję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali λ= 690 nm.

Przykład obliczeniowy absorbancji dla probówki nr 5:

∆E₄⁶⁹⁰= A_4WŁ-A_4K = 1,968 – 0,777 = 1,191

Aktywność proteinazy serynowej obliczono według wzoru:

A [µmole tyrozyny/min*ml] = k*∆E⁶⁹⁰*R

k- współczynnik uwzględniający odczyt z krzywej wzorcowej wykonanej dla roztworów tyrozyny oraz objętość enzymu i czas reakcji; k = 0,8

∆E⁶⁹⁰- absorbancja

R- rozcieńczenie

Przykład obliczeniowy dla probówki nr 6:

A₃ = 0,8*∆E₃⁶⁹⁰*R = 0,8*(1,944 – 0,963)*20 = 15,69

1. Wyniki i ich opracowanie:

Rys. nr 2. Tabela zbiorcza wyników ilości biomasy i wartości aktywności proteolitycznej enzymu, w zależności od czasu hodowli.

L.p.	Czas hodowli [h]	Biomasa (OD 660)	Aktywność proteolityczna [µmole tyrozyny/min*ml]
		I	II
1	13	3,1	3,4
2	23	2,9	5,2
3	28	3,7	2,7
4	37	4,0	8,4
5	46	7,0	8,7
6	52	8,5	9,3
7	61	10,7	10,7
8	67	10,7	10,2

Rys. nr 3. Wykres obrazujący wpływ czasu hodowli na ilość biomasy i aktywność enzymu.

1. Wnioski

Czas najwyższej aktywności proteolitycznej enzymu przypada na próbki, których czas hodowli wynosił od 55 h do 65 h. Powyżej punktu optymalnej aktywności, jej wartość spada. Optymalny czas aby uzyskać maksymalną wydajność proteinazy wynosi 50-60 godzin, a więc najlepszy czas hodowli bakterii Bacillus subtilis to ok. 50 – 60 h. Jest to końcowa faza wzrostu logarytmicznego, a początek fazy stacjonarnej. Próby kontrolne miały niższą wartość niż próby właściwe. W naszym doświadczeniu możemy zaobserwować wzrost zmętnienia. Oznaczenie zmętnienia dało nam możliwość określenia wzrostu biomasy. Zmętnienie jest pośrednim wskaźnikiem wzrostu, jest skutkiem namnażania się bakterii.