Dominik Jakubiak biotechnologia IV ROK
M. Kumar i wsp. Development of insect resistant transgenic cotton lines expressing cry1EC gene from an insect bite and wound inducible promoter. Journal of Biotechnology 140, 143-148
Rodzaj użytego genu, jego funkcje i roślina poddana transformacji:
Użyty gen cry1EC, pochodzący z Bacillus thuringiensis, który jest odpowiedzialny za kodowanie δ-endotoksyny. Aby ekspresja zachodziła na wysokim poziomie pod gen podpięto fuzyjny promotor (CaMV35S(r)PR-1a). Jest to promotor indukowany wyłącznie w obecności kwasu salicylowego lub przy uszkodzeniu tkanki roślinnej.
Rośliną poddawaną transformacji była bawełna.
Części rośliny wykorzystywane do transformacji:
Do transformacji użyto 8 mm eksplantaty tkanki hypokotylu oraz kawałki liścieni żywych z kiełkujących 5-7 dni siewek.
Metoda transformacji:
Eksplantaty zostały inkubowane metodą wektorową z użyciem Agrobacterium tumefaciens przez 15-20 minut, następnie wysuszone i przeniesione do medium kokultywacyjnego.
Protokół transformacji:
Wysterylizowane eksplantaty kiełkujących 5-7 dni siewek bawełny przez 15-20 minut inkubowano z Agrobacterium tumefaciens zawierającym podwójny wektor, odpowiednio przygotowanym, aby maksymalnie zwiększyć wydajność transformacji. Następnie eksplantaty osuszono bibuła Whatmana i przeniesiono do medium kokultywacyjnego na 3 dni w temperaturze 28oC w świetle rozproszonym. Po tym czasie przeniesiono je do pożywki indukującej wzrost kallusa zawierającego hygromycynę. Po 2-3 pasażach, tworzony kallus przeniesiono na pożywkę indukującą embriogenezę kallusa w odpowiednich warunkach selekcyjnych. Na koniec zarodki dłuższe niż 5 mm zostały przeniesione do odpowieniej pożywki i warunków wzrostowych.
Molekularna weryfikacja transformacji:
W celu dokładnej weryfikacji transformacji użyto kilku metod:
Amplifikacja genomowego DNA izolowanego z roślin miesiąc po transferze z użyciem cry1EC i odwrotnego do cry1EC promotora
Analiza przez hybrydyzację Southern Blot i ELISĘ
Analiza ekspresji GUS
Izolacja RNA, tworzenie cDNA i real-time PCR
Traktowanie hygromycyną i kanamycyną w celu selekcji mutantów
Technika bio-assay – sprawdzenie oddziaływania roślina-owad w warunkach laboratoryjnych
Rezultaty i wydajność transformacji:
Badania miały między innymi na celu porównanie wielkości ekspresji genu między podłączonym do promotora PR-1a a podłączonym do promotora fuzyjnego na przykładzie genu GUS. Wielkość ekspresji różniła się o ponad jeden rząd wielkości. Po transformacji uzyskano kilka linii o wyraźnej ekspresji genu cry1EC. Poddane działaniu owada S. litura, 2 linie wykazały 100 % przeżywalność (posiadały one w przeciwieństwie do pozostałych pojedynczą kopię insertu), 11 linii przeżywalnośc mniejszą niż 100 %, a 6 linii brak przeżywalności, natomiast dodatkowa indukcja przez uszkodzenie mechaniczne lub działanie kwasu salicylowego zwykle zwiększała znacznie przeżywalność każdej z linii.