Inżynieria genetyczna

Klonowanie DNA, transgenika

Tadeusz Adamski

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa

w Sulechowie

Wykład 5 i 6

2007

Klonowanie DNA, tylko studia dzienne, transgenika całość

19.03 (klonowanie DNA)

26.03 kolokwium cz. 1

2.04. transgenika

Wprowadzenie

• Analiza molekularna białek czy innych

składników budulcowych wymaga dużej ilości
materiału badawczego.

• Genom każdego organizmu jest duży i złożony,

a każda z interesujących nas sekwencji
występuje w jednej albo dwóch kopii

• Gen lub grupa genów odpowiedzialnych za

ekspresję białka lub innego produktu stanowi
więc znikomą część materiału genetycznego

Klonowanie DNA

• Klonowanie pozwala na wyodrębnienie określonych

sekwencji DNA spośród wielu innych sekwencji i

powieleniu ich w wystarczającej ilości do dalszych

eksperymentów.

• Podstawą klonowania DNA jest konstrukcja

zrekombinowanego DNA

• Przeznaczony do klonowania DNA poddaje się

rekombinacji z wektorowym DNA i wprowadza do

komórek gospodarza, w których ulega kopiowaniu.

Powstaje w ten sposób REKOMBINOWANY DNA.

• Rekombinowany DNA może ulegać replikacji

niezależnie od macierzystego genomu,

Wektor

• Wektor - autonomicznie powielająca się

cząsteczka DNA w której umieszczono
stosunkowo krótki fragment genomowego
DNA z interesującą nas sekwencją
(zawierająca np. gen) i pozwalająca na
namnożenie interesującego nas odcinka DNA

Klonowanie DNA, cd

• Przez powielanie się organizmu

gospodarza zawierającego
rekombinowany DNA tworzy się grupę
genetycznie identycznych organizmów,
czyli klon.

• Taki proces jest dlatego określany jako

klonowanie DNA

Etapy klonowania

ETAPY:
1. Wprowadzenie interesującej nas cząsteczki DNA ( np. genu) do

innej zwykle kolistej cząsteczki DNA (WEKTORA)

2. Wprowadzenie wektora do komórki gospodarza (najczęściej do

E.coli) W bakterii tej tworzą się liczne jego kopie.

3. W trakcie podziału komórki gospodarza zrekombinowane kopie

wektora przechodzą do komórek potomnych

4. Powstaje duża liczba kopii wektora, który można wyizolować z

komórek gospodarza.

Gospodarze i wektory

• Początkowa izolacja i analiza fragmentów DNA

jest prawie zawsze przeprowadzana z użyciem
bakterii E. colli, rzadziej drożdży.

• Wektory muszą posiadać gen selekcyjny,

pozwalający na wyselekcjonowanie komórek
gospodarza zawierających wektor, a więc
odróżnienie ich od takich, co go nie zawierają.

• Gen selekcyjny nadaje komórkom odporność na

związki dla nich toksyczne (np. antybiotyki) lub
umożliwia im przeżycie w określonych
warunkach hodowlanych.

Rekombinacja in
vitro

Rekombinacja in vitro polega na łączeniu DNA
wektora z DNA
dawcy.

Przebieg procesu rekombinacji DNA:

• nukleazy restrykcyjne rozpoznawają i rozcinają
DNA w ściśle określonych miejscach
• w wyniku działania restryktaz (np. EcoRI) powstają
odcinki dwuniciowego DNA z wystającymi na
końcach krótkimi odcinkami jednoniciowymi
• restryktaza EcoRI rozpoznaje np. układ zasad
GAATTC i przecina go między G i A

•

CAACGCTG

AATT

CGCATGC

GTTGCGAC

TTAA

GCGTACG

Sposób działania nukleazy
restrykcyjnej EcoRI.

Restryktaza EcoRI przecina układ GAATTC
miedzy G i A

CAACGCTG

^

AATTCGCATGC

GTTGCGACTTAA

^

GCGTACG

lepkie
końce

miejsce
cięcia

miejsce
cięcia

• Fragmenty uzyskane po trawieniu

poddaje się analizie lub
oczyszczeniu za pomocą
elektroforezy w żelu.

Elektroforeza w żelu

• W żelach agarozowych fragmenty

liniowego DNA są rozdzielane wg.
wielkości przez migrację w polu
elektrycznym w przestrzennej
sieci żelu agarozowego.

Rodzaje wektorów

• 1.Plazmidy
• 2. Fag lambda
• 3. Kosmidy

Plazmidy

• 1. Plazmidy bakteryjne – są to małe,

koliste cząsteczki DNA, które replikują się
niezależnie od genomu gospodarza i
zawierają geny odporności na antybiotyki.

• U E. coli występują w wielu kopiach

(nawet do kilkuset) i zawierają region
początku replikacji (ori), który pozwala na
niezależne namnażanie się w komórkach.
Zawierają zazwyczaj kilka genów

•

Plazmidy są łatwe w izolacji i nadają bakteriom
odporność na antybiotyki: ampicylina,
tetracyklina

•

Procedura klonowania za pomocą
plazmidów składa się z wielu etapów:

1. Trawienie plazmidu enzymem restrykcyjnym.

Powoduje to przecięcie plazmidu w jednym
miejscu, zmieniając do z formy kulistej na
liniową z lepkimi końcami

.

Procedura klonowania, cd,

2. Trawienie obcego DNA tym samym

enzymem restrykcyjnym , generującym
te same lepkie końce

3. Po zmieszaniu plazmidu z obcym DNA

ich cząsteczki łączą się poprzez lepkie
końce i powstają zrekombinowane
koliste plazmidy

Transformacja

4. Zrekombinowany plazmid wprowadza się do

bakterii gospodarza w procesie zwanym
transformacją.

5. Transformowane bakterie wysiewa się na szalki z

agarem. Hodując bakterie na szalkach z agarem
zawierającym antybiotyk uzyskuje się bakterie, do
których podczas transformacji został
wprowadzony plazmid. Dzięki genom na
plazmidzie bakterie takie są oporne na antybiotyk
i dlatego przeżywają na zawierającej go pożywce.

Plazmid pBR 322 zawiera dwa geny odporności:

na ampicylinę i tetracyklinę.

Obcy DNA wprowadza się na miejsce odporności

na tetracyklinę powodując jego inaktywację

Stransformowane bakterie ze zrekombinowanym

DNA można zidentyfikować, ponieważ są
oporne na ampicylinę, i równocześnie
wrażliwe na tetracyklinę

• Z uwagi na ochronę środowiska, coraz częściej stosuje

się wektory pozwalające na identyfikację
zrekombinownych plazmidów metodą zwaną
biały/niebieski

• Metoda opiera się na obecności genu lac,

pozwalającego na zabarwienie się kolonii bakterii (w
pewnych warunkach) na kolor niebieski. Po
wprowadzeniu na miejsce tego genu obcego DNA, gen
ten zostaje zablokowany, a kolonie bakterii pozostają
białe. Kolonie o zabarwieniu niebieskim będą bez
wstawki DNA.

Fag lambda

• Fagi są wirusami infekującymi bakterie,

zbudowane z genomu złożonego z kwasu
nukleinowego otoczonego płaszczem białkowym
zwanym kapsydą. Fag przyczepia się do
powierzchni bakterii i wstrzykuje jej swój DNA.
W komórce bakterii DNA faga się powiela,
następnie jest pakowany do kapsydy i na skutek
rozpadu komórki bakterii uwalniany na zewnątrz.

• Centralna część DNA faga nie ma wpływu na

infekcję. Można więc go zastąpić interesującym
nas fragmentem DNA.

Fag lambda

•

Zrekombinowane fagi wysiewa się na szalkę z
agarem , na której powieszchni wyhodowano
wcześniej warstwę bakterii zwaną „murawą”. Po
wysianiu fagów pojawiają się „łysinki” wskazujące iż
nastąpiła tam liza (rozpad) komórek bakterii, czyli
infekcja komórek E. coli. Poszczególne miejsca
infekcji można wyizolować i użyć do produkcji dużej
ilości klonowanego DNA poprzez infekcję świeżych
kultur E. Coli.

•

Poprzez faga lambda można wprowadzić
fragmenty do 25kpz, natomiast do plazmidów
poniżej 10kpz

Biblioteka DNA

• Bibliotekę DNA (biblioteka genomowa , biblioteka cDNA)

może tworzyć między innymi zbiór zrekombinowanych

fagów, których klony zawierają fragmenty sekwencji DNA

reprezentujące cały genom organizmu.

• Sporządza się je poprzez rozerwanie DNA na przypadkowe

fragmenty wielkości około 20 kpz przy pomocy enzymu

restrykcyjnego albo mechanicznie , łączenie ich z

ramionami faga lambda i losowe klonowanie.

• Identyfikację przeprowadza się najczęściej za pomocą

sondy metodą „odcisku”. Polega ona na przyłożenie do

szalki z agarem odpowiedniego filtra, na którym odbijają

się „łysinki”. Znajdujący się na filtrze DNA poddaje się

hybrydyzacji ze znakowaną najczęściej radioaktywnie

sondą. W ten sposób można poznać sekwencję DNA

Kosmidy

• Kosmid - wektor do klonowania o dużej

pojemności.

• Kosmidy posiadają wszystkie typowe cechy

występujące w plazmidach a także sekwencje
występujące w fagu odpowiedzialne za
wprowadzenie do fagowego kapsydu.

Zrekombinowane białka

• Klonowanie genów wykorzystuje się do

produkcji dużych ilości białek stosowanych w
medycynie (np. insulina).

• Geny kodujące pożądane białka klonuje się w

wektorach ekspresyjnych wprowadzonych do
odpowiedniego gospodarza (np. drożdże).
Uzyskuje się tą drogą duże ilości produktu
kodowanego przez wprowadzony sztucznie do
komórki gen.

Inżynieria genetyczna.

2. Otrzymywanie roślin

transgenicznych

Ograniczenia hodowli tradycyjnej:

• długi czas realizacji celu,

• konieczność selekcji w dużych liczebnie
populacjach,

• trudność powtórzenia danego efektu.

Hodowla

transgeniczna

zmniejsza

siłę

oddziaływania tych ograniczeń.

Odnalezienie w genomie dowolnego genu
wywołującego pożądaną ekspresję danej cechy,
a następnie przeniesienie go do organizmu
biorcy stanowi istotę inżynierii genetycznej.
W hodowli transgenicznej geny są izolowane i
konstruowane metodami inżynierii genetycznej
oraz

wprowadzane

do

biorcy

na

drodze

transformacji

Etapy hodowli transgenicznej

 
1. Postawienie celu hodowli.
Czynniki które najsilniej wpływają na określenie celu

to:

• strategia firmy,

• stan wiedzy

• efekty ekonomiczne

2. Wybór genu.
Decyzja ta musi być poprzedzona:

• dokładną analizą mechanizmu powstawania

określonej cechy,

• stanu wiedzy o roli danego genu i powiązaniach z

innymi genami,

• stanu własności intelektualnej

• strategii firmy.

3. Wybór odmiany do transformacji.

Etapy hodowli
transgenicznej c.d.

4. Wybór i wytworzenie transgenu.

5. Wytwarzanie odmian
transgenicznych.

CAACGCTG

AATT

CGCATGC

GTTGCGAC

TTAA

GCGTACG

Sposób działania nukleazy
restrykcyjnej EcoRI.

Restryktaza EcoRI przecina układ GAATTC
miedzy G i A

CAACGCTG

^

AATTCGCATGC

GTTGCGACTTAA

^

GCGTACG

lepkie
końce

miejsce
cięcia

miejsce
cięcia

1. Identyfikacja genu kodującego

interesujące nas białko

Identyfikację genu można przeprowadzać między

innymi poprzez wykorzystanie metod
bioinformatycznych

- dysponując białkiem możemy określić kolejność

aminokwasów

- znając kolejność aminokwasów możemy ustalić

kod genetyczny eksonów

Zasady inżynierii genetycznej

2. Przeniesienie genu z gatunku, w

którym

występuje

naturalnie

do

gatunku,

w

którym

chcemy

go

umieścić.

Wycięcie genu przeprowadza się za pomocą
enzymów restrykcyjnych zdolnych do przecinania
nici

w

miejscu

występowania

określonej

sekwencji. Manipulowanie genem wymaga jego
namnożenia.

Przeprowadza

się

to

drogą

klonowania lub techniką PCR. Po namnożeniu
genu przenosi się go do organizmu biorcy.
Najpopularniejsze techniki wprowadzania DNA
do organizmów biorcy to bezpośrednia i
wektorowa transformacja genetyczna

Bezpośrednia transformacja
genetyczna

• mikrowstrzeliwanie „strzelbą genową”,
• mikrowstrzykiwanie,
• elektroporacja,
• wstrząsanie roztworu zawierającego zawiesinę

komórek oraz obcy DNA i węglik krzemu.

Proces wektorowej transformacji genetycznej

możemy podzielić na trzy etapy:

1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA

2. Wprowadzenie odcinka DNA dawcy do wektora

- rekombinacja in vitro

3. Wprowadzenie wektora niosącego w sobie DNA

dawcy do organizmu biorcy, w taki sposób by
wprowadzony DNA przeszedł z wektora do
komórki biorcy

Wektorowa transformacja
genetyczna

Wektorem nazywamy organizm, który umożliwia
nam przeniesienie DNA od dawcy do biorcy

Jeżeli tą samą restryktazą przetniemy DNA
wektora (np.plazmidu) i DNA organizmu
dawcy, to wszystkie powstałe fragmenty będą
miały te same lepkie końce a połączenie
pociętego DNA u wektora zajdzie samorzutnie
za pomocą enzymu ligazy.

Do przenoszenia interesującego odcinka DNA
dawcy do biorcy
wykorzystuje się swoiste wektory, którymi są
najczęściej plazmidy.

Powszechnie wykorzystuje się w tych pracach
bakterię Agrobacterium tumefaciens. Bakterie z
rodzaju Agrobacterium posiadają zdolność do
infekowania roślin w miejscach zranień i
przekazywania własnego plazmidu, który ulega
integracji z genomem komórki roślinnej. Proces
ten nazywamy agroinfekcją.

Plazmidy są to koliste odcinki podwójnej nici DNA,
nie związane z głównym aparatem genetycznym
bakterii.
Najczęściej stosowana jest infekcja protoplastów
lub zawiesiny
komórek poprzez kokulturę z bakteriami.

Plazmidy A. tumefaciens zawierają swoisty
odcinek Ti, replikujący się niezależnie od
chromosomu bakteryjnego.

Istotą procesu naturalnej transformacji roślin jest

przekazanie przez bakterie komórkom roślinnym
właśnie fragmentu Ti.

We fragmencie tym znajdują się onkogeny oraz geny

odpowiedzialne za syntezę tumorów (rakowych narośli).

W przypadku hodowli roślin transgenicznych wycina się

przy pomocy enzymów restrykcyjnych odcinek DNA,
produkujący onkogeny i tumory a następnie na jego
miejsce wprowadza się interesujący nas gen (fragment
DNA).

W pracach tych konieczne jest wprowadzenie genu

markerowego -genu odporności na antybiotyk lub genu
wywołującego fluorescencję co pozwoli w dalszych
etapach na wyszukiwanie roślin z udaną transformacją.

Roślina zainfekowana taką bakterią nie będzie jednak

produkować opin czy narośli tylko produkt
determinowany przez wprowadzony gen.

Inżynieria genetyczna roślin

-przykłady

Pomidory o przedłużonym okresie dojrzewania

Enzym

poligalakturonazy

(PG)

powoduje

w

dojrzewającym owocu
rozkład substancji spajających sąsiednie komórki.
Zahamowanie syntezy PG nie zaburza procesu
dojrzewania lecz spowalnia proces
mięknięcia owoców.
Metodami

inżynierii

genetycznej

wyhodowano

pomidora nie
syntetyzującego PG techniką antysensownego RNA

Transgeniczne rośliny produkujące

substancje farmakologiczne

1. Szczepionki w roślinach
2. Szczepionki w zrekombinowanych wirusach roślinnych

1. Szczepionki w roślinach

2. Szczepionki w zrekombinowanych wirusach roślinnych

Rośliny uprawne odporne

na herbicydy

Rośliny transgeniczne

odporne na szkodliwe

owady

Bacillus thuringnsis jest powszechnie występującą
bakterią (w pyle, kurzu, glebie). Są wykorzystywane
jako biologiczny insektycyd. Podczas tworzenia
przetrwalników powstają białka Cry, które po
połknięciu przez owada powodują jego śmierć.
Wprowadzenie odpowiednich genów "pobranych" z
bakterii

i

wprowadzenie

do

genomu

chloroplastowego spowodowało, iż transformowane
rośliny stały się zabójcze dla wielu szkodliwych
owadów (ale nie mszyc).
Przykłady:
1. Ziemniak "New leaf" Monsanto - 1995r., stonka
2. Bawełna "Bollbard" Monsanto - 1996r.
3. Kukurydza - kilka firm, omacnica prosowianka

W krajach UE obowiązuje bardzo restrykcyjne prawo
dotyczące uprawy roślin transgenicznych oraz
obecności żywności czy innych produktów
pochodzących z roślin transgnicznych.

Zgodnie z uchwałą Parlamentu Europejskiego
rozróżniamy następujące grupy żywności
modyfikowanej genetycznie:

1. żywność i jej składniki zwierające lub będące GMO
Przykłady: modyfikowane pomidory, truskawki, czy
też lody truskawkowe produkowane z tych owoców.

2. żywność i składniki produkowane z GMO, lecz nie
zawierające GMO 
Przykłady: olej produkowany z rzepaku odpornego na
patogeny lub herbicydy oraz produkty w skład
których ten olej wchodzi.

Przepisy prawne dotyczące hodowli i
obrotu GMO (organizmów
modyfikowanych genetycznie)

 

 Obecność obcych genów w roślinie nie stanowi
zagrożenia, gdyż są szybko trawione w
przewodzie pokarmowym. Zagrożenie stanowi
interakcja nowo powstałego organizmu ze
środowiskiem oraz możliwość pojawienia się
toksyn, czy substancji alergennych.

 Najlepszym sposobem oceny bezpieczeństwa
produktu spożywczego pochodzącego z GMO jest
jego porównanie z odpowiadającym mu
konwencjonalnym produktem uważanym za
bezpieczny.

Powszechnie

przyjętą

koncepcją

oceny

bezpieczeństwa produktów biotechnologicznych
jest koncepcja równoważności składnikowej.

Zgodnie z ta teorią, jeżeli nowy produkt spożywczy
jest chemicznie i żywnościowo równoważny z
produktem dotychczas istniejącym i uważanym za
bezpieczny (konwencjonalnym) to ten produkt
należy uznać również za bezpieczny.

Dotychczas nie znane są przypadki szkodliwego
wpływu spożywania GMO na zdrowie konsumentów.

  W Unii Europejskiej (i w Polsce) wymagane jest
znakowanie wszystkich produktów, które zostały
wytworzone metodami inżynierii genetycznej.