Uniwersytet Warmińsko-Mazurski

w Olsztynie

Wydział Kształtowania Środowiska i Rolnictwa

Kierunek: Ochrona środowiska

.

Ćwiczenie 2

Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej

Zacharewska Ewelina Katarzyna

Studia II°, Rok I

grupa A

Olsztyn 2013

Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej

Fosfatazy stanowią grupę enzymów należących do klasy hydrolaz (enzymów rozszczepiających wiązania z udziałem cząsteczki wody), podklasy enzymów hydrolizujących wiązania estrowe oraz podpodklasy monoestrów fosforanowych. Pełnią one zasadniczą rolę podczas przemian organicznych związków fosforu w nieorganiczne fosforany ( HPO₄^2-, H₂PO₄^-), które stanowią formy łatwo dostępne dla roślin i organizmów glebowych. Ponadto opisywane enzymy katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców, nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według reakcji:

R-OPO₃H₂ + H₂O R-OH+ H₃PO₄

Wśród fosfataz można wyróżnić: fosfomonoesterazę alkaliczną, działającą przy optymalnym pH 8- 10 oraz fosfomonoesterazę kwaśną, zwaną potocznie fosfatazą kwaśną, dla której optymalne pH mieści się w zakresie od 3,4 do 6,2. Według Hoffmana wyróżnić należy także trzeci rodzaj fosfatazy, zwaną fosfatazą obojętną, która największą aktywność wykazuje przy pH 6,5-7,0.

Wszystkie z wymienionych wcześniej typów fosfataz, należą do enzymów powszechnych w środowisku glebowym, a także w świecie roślin i zwierząt. Wśród głównych źródeł ich występowania wyróżnić można mikro i makroorganizmy glebowe oraz korzenie roślin.

Zasada metody:

Podczas oznaczenia aktywności fosfatazy kwaśnej wykorzystuje się reakcję, w której naturalny substrat fosfatazy kwaśnej zostaje zastąpiony sztucznym - p-nitrofenylofosforanem.

Badany enzym hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku zasadowym tworzy żółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy.

O

O₂N O P OH + H₂O O₂N OH + H₃PO₄

O

p-nitrofenylofosforan (pNPP) p-nitrofenol (pNP)

Natężenie barwy mierzone przy λ = 410 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego substratu. Ryc. 4 przedstawia widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pNPP) i p-nitrofenolu (pNP).

Wykonanie oznaczenia:

Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia wymieszano, przy użyciu bagietek, glebę w trzech zlewkach. Następnie umieszczono po 1g badanej gleby w trzech kolbach stożkowych o pojemności 50cm³ każda, po czym kolejno dodawano:

- 4 cm³ buforu o pH 6,5;

- 0,25 cm³ chloroformu;

- 1 cm³ roztworu 4- nitrofenolofosforanu sodowego (PNP);

Zawartość kolbek wymieszano przez kilka sekund, zamknięto kolbki korkiem i wstawiono do termostatu na 60 minut ( temperatura 37°C). Podczas, gdy kolbki znajdowały się w termostacie przygotowano zestawy do sączenia, składające się z:

- kolbek miarowych o pojemności 50 cm³;

- lejków plastikowych;

- trzech twardych sączków;

Po wyjęciu kolbek z termostatu, bezpośrednio przed sączeniem do badanej gleby dodano:

- 1 cm3 roztworu 0,5 M CaCl2 2H2O;

- 4 cm3 roztworu 0,5 M NaOH – w celu przerwania reakcji;

Następnie przeniesiono zawartość inkubowanych kolbek oraz pozostałości po przepłukaniu kolbek wodą destylowaną na sączki, po czym napełniono każdą z kolbek wodą destylowaną do objętości 50 cm³ (do kreski) i wymieszano. Ostatnim etapem było wykonanie pomiaru ekstynkcji, powstałego w wyniku przeprowadzonej reakcji, 4-nitrofenolu (PN) na spektrofotometrze przy długości fali λ= 410 nm. Wyniki wykonanych przez całą grupę pomiarów zestawiono w tabeli nr 1.

Część obliczeniowa:

Obliczenia do tabeli wykonywano według poniższego wzoru:

Pac= $(Eb - Ek)*\ \frac{C*1000*100}{Ec*1000*\% s.m.}$

Pac- mmol PN∙kg^-1p.s.m. ∙ h^-1

E_b- wartość ekstynkcji próbki badanej

E_c- suma ekstynkcji wszystkich punktów wzorca (2,167)

E_k- wartość ekstynkcji próbki kontrolnej

C- suma stężenia PN(μmole) wszystkich punktów wzorca (6,4)

100*p.s.m^-1- przelicznik na suchą masę gleby

% s.m.- zawartość suchej masy w glebie (%)

1000- zamiana mikromoli na milimole

Badany przeze mnie w tym ćwiczeniu materiał glebowy stanowi gleba nr 4 z dodatkiem wapnia bez dodatku zanieczyszczenia, w postaci benzyny (nr 6 w tabeli). Obliczenia wykonane dla tej próby przedstawiają się następująco:

E_b=( $\frac{(0,435\ + \ 0,480\ + \ 0,390)}{3}) = 0,435$

E_c = 2,167

E_k = 0,055

C- 6,4 μmoli PN

100*p.s.m^-1- przelicznik na suchą masę gleby

% s.m= $\frac{100\%*100g}{121,076g}$ = 82,59%

1000- zamiana mikromoli na milimole

Pac= $\left( 0,435 - 0,055 \right)*\ \frac{6,4\text{μmoli\ PN}\ *1000*100}{2,167*1000*82,59\% s.m.}$= $\left( 0,435 - 0,055 \right)*\ \frac{640000\ mmoli\ PN}{178972,53\%\ s.m.}$

Pac = 0, 380 * 3, 5759 = 1, 358867 ≈ 1, 359

Rys.1. Wartość aktywności enzymatycznej fosfatazy kwaśnej w badanej glebie

Rys. 2. Wykres odchylenia standardowego otrzymanych wyników

WNIOSKI:

Na podstawie uzyskanych danych stwierdzić można, iż w glebie zanieczyszczonej benzyną aktywność fosfatazy kwaśnej maleje. Próbki 1-5, do których dodana była benzyna w coraz to większych stężeniach wskazuje na zmniejszenie się aktywności badanego enzymu. Wyjątek stanowi tu obiekt nr 4- wynik otrzymany przez osobę wykonującą pomiar jest mało wiarygodny, czego powodem jest pozostawienie odcisków palców na kuwecie. Podobnie sytuacja wygląda w przypadku obiektu nr 10 oraz 14.

Wyniki otrzymane z obiektów nr 6-9 także wskazują na spadek aktywności fosfatazy kwaśnej. Materiał glebowy poddany badaniu stanowiła w tym przypadku gleba z dodatkiem wapnia, którą zanieczyszczono benzyną. Porównując wyniki próby 1 z wynikiem próby nr 6 zauważyć można, że aktywność fosfatazy kwaśnej w glebie z dodatkiem wapnia jest większa, natomiast po dodaniu benzyny do gleby z wapniem nastąpił gwałtowny spadek aktywności badanego enzymu.

Wyniki z obiektów nr 11- 15 (bez 14) – gleba z dodatkiem azotu zanieczyszczona benzyną – wskazują na stały poziom utrzymywania się aktywności fosfatazy kwaśnej.