Agrobiotechnologia - wykłady

Roślinne kultury tkankowe – aseptyczne kultury komrek, tkanek i organów wyizolowanych z roślin macierzystych, prowadzone In vitro na syntetycznych pożywkach, w ściśle określonych warunkach fizycznych i chemicznych.

Eksplantaty – wyizolowane fragmenty roślin.

Rodzaje eksplantatów

1. Zawierające komórki niezróżnicowane, zdolne do podziałów

- merystemy pierwotne: merystemy wierzchołkowe pędów i korzeni, merystemy pachwinowe, merystemy interkalarne – trawy, rdestowate

- merystem wtórne: kambium (miazga), fellogen (miazga korkotwórcza wytwarzana przez perycykl), archespor męski, archespor żeński.

2. Zawierające komórki zróżnicowane, nie zdolne do podziałów, ale zdolne do odróżnicowania. Komórki rdzenia, kory – korzenia i pędu; komórki skórki.

3. Komórki niezdolne do odróżnicowania, komórki bardzo zróżnicowane, wyspecjalizowane strukturalnie i fizjologiczne – włoski, sklerenchyma, cewki, włókna, komórki przyszparkowe.

Historia roślinnych kultur In vitro.

XIX w – teoria komórkowa

1902 – teoria totipotencji komórek (przez Haberiandta) – każda żywa komórka jest zdolna do odtworzenia całego organizmu.

Lata 20 i 30 – kultury odciętych wierzchołków wzrostu korzeni niedojrzałych zarodków

1939 – kultury ciągłe tkanek roślinnych

Lata 30 – koncepcja hormonalnej kontroli organogenezy

Lata 50 – kultury zawiesin (mnożenie z wierzchołków wzrostu, mnożenie z pąków bocznych, somatyczna embriogeneza)

Lata 60 – regeneracja roślin z pojedynczych organów

Lata 70 – mieszańce somatyczne, kultury mikroskopowe

Lata 80 – praktyczne zastosowanie kultur In vitro w hodowli i produkcji (selekcja In vitro, produkcja metabolitów wtórnych, transformacja)

Działy biotechnologii

- czerwona biotechnologia – ochrona zdrowia

- biała biotechnologia – produkcja przemysłowa, ochrona środowiska

- zielona biotechnologia – rolnictwo

Tok prac technicznych

1. Uprawa roślin w polu szklarni lub w warunkach regulowanych (roślina macierzysta, organy też są ważne – wiek, lokalizacja, termin izolacji, orientacja na pożywce; rośliny młode, powinny być zdrowe, żywotne, intensywny wzrost, rosnąć w warunkach optymalnych)

2. Mycie i sterylizacja szkła laboratoryjnego i narzędzi

3. Przygotowanie i sterylizacja pożywek

4. Przygotowanie i dezynfekcja materiału roślinnego

5. Izolacja i wykładanie eksplantatów na pożywkę

6. Pasażowanie kultur

7. Przenoszenie roślin z kultur do warunków naturalnych i wzrost ex vitro

Ad 1: obieranie skórki i mycie pod bieżącą wodą

Ad 2: na mieszadle magnetycznym lub wytrząsarce – zależy od wielkości materiału roślinnego

Ad 4: Etapy

1. Wstępne oczyszczanie i cięcie roślin

2. Dezynfekcja chemiczna (wstępna i właściwa)

3. Płukanie w wodzie destylowanej sterylnej

Środki stosowane do dezynfekcji

- podchloryn wapnia Ca(OCL)2

- podchloryn sodu

- chloroamina

- S-hydroksychinolina

- sublimat – chlorek rtęci

- woda bromowa

- woda utleniona

- ace, domestos

Trzeba je odpowiednio dobrać czasowo.

Chloorgany endofityczne zwalczamy metodami chemicznymi np. antybiotykami, fungicydy lub metodami fizycznymi – zabieg termoterapii.

Płukanie w wodzie destylowanej w celu zwalczenia środków pieniących, przerywa dezynfekcje chemiczną.

Pożywki

- White (1943)

- Murashige i Skoog (1962) – MS

- Garborg (1968) – BS

- Linsmaier I Skoog (1965) – LS

- Nitch I Nitch (1969) – NN

- Chn (1978) – NG

Składniki

1. Makroelementy

2. Mikroelementy

3. Związki organiczne (witaminy, B1, B3, B6, mezoinozytol – precursor witamin, C I E – przeciwutleniacze – zapobiegają brunatnieniu)

4. Aminokwasy – glicyna

5. Cukier – sacharoza, glukoza, fruktoza, maltoza

6. Węgiel aktywowany – w celu absorpcji wydzielin komórkowych mających negatywny wpływ na rozwój kultury

7. Dodatki pochodzenia naturalnego – ekstrakty drożdżowe, mleczko kokosowe, woda kokosowa, wyciąg z bananowca, z bulw ziemniaczanych, wyciągi z wsiewek

8. Regulatory wzrostu

9. Substancje zestalające – agar – wyciąg z krasnorostów, perlit, fito żel

10. pH – 5,6 – 5,8 dla niektórych się obniża.

Składniki mineralne

- organogenezy: C, H, O

- niemetale: N, S, P, B – aniony

- metale alkaliczne: K, Na, Mg, Ca – kationy

- metale ciężkie: Fe, Mn, Cu, Zn, Mo – kationy lub chylaty metali

Azot – białka, enzymy, aminokwasy, kwasy nukleinowe, forma nieorganiczna No₃^- lub NH₄⁺, azotany, sole amonowe, forma organiczna aminokwasy (glicyna, glutamina)

Siarka – białka, aminokwasy, witaminy, forma nieorganiczna, siarczany SO₄^-

Fosfor – cukrowce, nukleotydy, kwasy nukleinowe, związki nieorganiczne, pochodne kwasu ortofosforowego H₂Po₄^-, HPO₄^-

Potas – synteza białek, fotosynteza, aktywator enzymów, związki nieorganiczne, azotany, fosforany, siarczany K⁺

Magnez – chloroplasty, aktywator enzymów w procesie fotosyntezy i oddychania, rybosomy, związki nieorganiczne, siarczan magnezu Mg⁺⁺

Wapń – ściany komórkowe, budowa błon cytoplazmatycznych, transport auksyn, mitochondria, sole wapnia rozpuszczalne w wodzie, azotany najłatwiej, siarczany trudniej Ca⁺⁺

Regulatory wzrostu - fitohormony (substancje wzrostowe) związki organiczne, które stosujemy w bardzo małych ilościach (wykluczające działanie troficzne), związki te wpływają na procesy wzrostu i rozwoju – auksyny, cytokininy, gibereliny, inhibitory wzrostu, etylen. Są endogenne i egzogenne.

- auksyny – związki organiczne o charakterze kwasów, mają zdolność wywoływania wzrostu wydłużeniowego (elorgacyjnego) oraz powodują mitozy (podziały jąder komórkowych).

Wpływ na rośliny: wydłużanie komórek w strefie wzrostu, podziały komórek i powstawanie kalusa, dominacja wierzchołkowa (hamowanie pąków bocznych), starzenie kultur, tworzenie zawiązków korzeni przybyszowych.

Budowa chemiczna: kwas indolilo-3-octowy (IAA) naturalny, kwas indolilo-3-masłowy (IBA), kwas naftylo-1-octowy (NAA), 2,4 D, Pichloram, Dicamba

- cytokininy – związki organiczne, które przyśpieszają cytokinezę komórek roślinnych.

Wpływ na rośliny: wpływają na podziały komórek (działają wspólnie z auksynami), powodują wydłużanie komórek, lecz w mniejszym stopniu niż auksyny, znoszą dominacje wierzchołkową, pobudzają do rozwoju pąki boczne, powstrzymują starzenie organów roślinnych, inhibicja korzeni

Syntetyczne: pochodne 6-aminopuryny, kinetyza, 6-benzyloaminopuryna (BAP, BA), 6-aminopuryna (adenina), pochodne fenylomocznika

A>C – korzenie – IAA, IBA, NAA (jeśli 2,4 D, pik loran, dicamba>kalus)

A<C – pędy

- gibereliny - GA> GA₅₈, GA₃ – popularny

Działanie: (+A) podziały i wydłużanie komórek, aktywne w testach kantowych nitontów, (-A) nie stymulują wzrostu korzeni korzeni, nie tworzą kalusa

- etylen – C₂H₄ – gaz, powstaje w młodych tkankach, merystemach, pod wpływem auksyn, pod wpływem uszkodzeń tkanki.

Działanie: niskie stężenie stymuluje rozwój pąków przybyszowych, wysokie stężenie hamuje: rozwój pąków przybyszowych, ukorzenianie, somatyczną embriogenezę.

- inhibitory wzrostu – kwas abscysynowy (ABA), inhibitory fenolowe: kwas salicylowy, galusowy, retardanty: chlorek chloro choliny, pochodne kwasu sykcynylowego – alar, pochodne triazoli (pachobutrazol)

Działanie: hamują wzrost elongacyjny, antagonistyczne do auksyn, giberelin, cytokinin

In vitro: indukcja spoczynku (kwas abscysynowy), indukcja cebul przybyszowych (pachobutrazol), indukcja korzeni przybyszowych (floroglucynol), przeciwdziałają szklistości (nadmierne uwodnienie tkanek – floroglucynol), przyśpieszają aklimatyzacje (odporność na stres – kwas abscysynowy), wpływają korzystnie na dojrzewanie zarodków somatycznych (kwas abscysynowy).

Warunki fizyczne w kulturach In vitro

Temperatura:

- najczęściej: 17-25⁰C

- rośliny tropikalne: do 32^oC

- rośliny cebulowe, drzewa często wymagają określonego przechłodzenia około 5^oC

- odpowiednią temperaturę należy ustalić w zależności od badanego gatunku i reakcji eksplantatu

Światło:

- odgrywa podstawową rolę w regulacji metabolizmu i morfogenezy (wzrost i różnicowanie roślin In vitro)

- długość fali świetlnej: światło fotosyntetyczne aktywne: 400-700 mm

Światło czerwone: indukcja kalusa

- natężenie światła: 20-70 umol n^-2s^-1

- fotoperiod (czas ekspozycji) – rośliny dnia krótkiego, długiego, neutralne)

- ciemność – indukcja kalusa, SE (somatyczna embriogeneza), indukcja korzeni.

Wilgotność: wilgotność względna – określa zawartość pary wodnej w fazie gazowej naczynia, w którym jest prowadzona kultura (ponad powierzchnią pożywki). Zależy od: temperatury, składu chemicznego, pożywki, wielkości eksplantatu i rozmiarów naczynia. Najbardziej odpowiednia wilgotność względna w pomieszczeniu: ok. 70%

Tlen i CO₂: Stężenie zależy od: wielkości eksplantatu (ich intensywność oddychania, fotosyntezy czy transpiracji), składu podłoża, a także od wielkości i kształtu naczynia.

Metody rozmnażania wegetatywnego:

Mikrorozmnażanie (mikropropagacja) = klonowanie roślin In vitro

- pobudzanie do rozwoju pąków bocznych (pąki kątowe i pachwinowe)

- formowanie pąków przybyszowych

- embriogeneza somatyczna

Stadia mikrorozmnażania roślin w kulturach In vitro

1. Stadium O (stadium przygotowawcze) – wybór rośliny macierzystej i ocena jej stanu zdrowotności, eliminacja zakażeń: opryski, termoterapia, weryfikacja skuteczności zabiegów

2. Stadium 1 (inicjacja i stabilizacja aseptycznej kultury) – izolacja eksplantatów, dezynfekcja chemio i termoterapia In vitro, ustabilizowanie eksplantatów na odpowiedniej pożywce

3. Stadium 2 (namnażanie – rozmnażanie klonalne) – rozwój struktur już istniejących lub powstawanie przybyszowych, regeneracja roślin, ewentualnie powtarzanie tego stadium, aż do uzyskania oczekiwanej liczby roślin.

4. Stadium 3 (przygotowanie do warunków In vitro) – rozdzielanie wieloroślinek (skupiska pędów) na pojedyncze pędy, wydłużanie pędów (stosowanie gibereliny), ukorzenianie roślin (auksyna), bioryzacja In vitro (bakteryzacja – izokulowanie bakteridium symbioticum, mikoryzacja – wprowadzanie grzybów nikoryzowych – tydzień przed wysadzeniem roślin In vitro, obserwowany niedorozwój systemu korzeniowego, zabieg bioryzacji może wpłynąć korzystnie na formowanie korzeni.

5. Stadium 4 (przeniesienie do warunków In vitro i aklimatyzacja) – oczyszczanie roślin z resztek pożniwnych, aklimatyzacja w warunkach naturalnych lub w szklarni. Przystosowanie roślin do nowej wilgotności. W celu ich przystosowania do niższej wilgotności możemy zastosować między innymi na ½ dni przed wysadzeniem stosujemy rozszczepienie kultur – otwiera się materiał. Po wysadzeniu przez ½ tygodnie utrzymujemy wysoką wilgotność w pomieszczeniu grawitacyjnym. Rośliny po wysadzeniu przykrywa się folią, zrasza się i stopniowo obniżamy. Na kilka dni przed przeniesieniem roślin do worków zwiększa się natężenie światła w celu pobudzenia roślin do fotosyntezy. Aby przystosować niektóre gatunki (cebulowe i drzewa) stosuje się chłodzenie albo oprysk giberelinowy. Stosuje się go czasami u roślin dwuletnich – wernalizacja (niekiedy u ozimych). Można ją też zanurzyć w preparacie grzybobójczym.

6. Stadium 5 – testowanie roślin: zdrowotność, stabilność genetyczna.

Pobudzanie do rozwoju pąków wierzchołkowych oraz bocznych (pachwinowych)

Eksplantaty wykładamy na pożywkę z cytokininą – pobudza do rozwoju merystemy)

- merystemy pąków wierzchołkowych lub bocznych, również całe pąki

- fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąkiem bocznym

Otrzymujemy materiał stabilny genetycznie.

Kultury merystemów – możemy uzyskać rośliny zdrowe, wolne od wirusów. Merystemy są 0,1-0,2 mm. Im mniejszy merystem tym większa szansa do rozwinięcia. Poddaje się rośliny chemioterapii lub termoterapii, krioterapii (schładzanie od 1-5^oC), bądź zamrażamy w temperaturze -196^oC. W przypadku chemioterapii stosuje się substancje, które hamują bądź uszkadzają RNA wirusa. Przez izolacje merystemów rozmnażają się storczyki, goździki.

Formowanie pąków przybyszowych (morfogeneza przybyszowa)

Polega na regeneracji roślin w wyniku powstawania nowych organów takich jak pędy, korzenie, cebule pod wpływem pożywki. Liść> eksplantat> tworzą się pąki> powstają pędy. Nowe organy nazywane są organami przybyszowymi. Tworzenie organów przybyszowych odbywa się w sposób bezpośredni lub pośredni czyli poprzez powstawanie kalusa (stadium). Zależy to od eksplantatów. Jeżeli w eksplantatach wyjściowych znajdują się komórki kompetentne to wtedy obserwujemy morfogenezę bezpośrednią. Jeżeli komórki wyizolowane z rośliny macierzystej nie mają kompetencji do morfogenezy to pod wpływem czynników kultury In vitro podlegają one odróżnicowaniu do stanu merystema tycznego. Komórki te poprzez szybkie podziały doprowadzają do wytworzenia kalusa i dopiero w komórkach kalusa dochodzi do indukcji kompetencji i różnicowania się w określonych kierunku.

Somatyczna embriogeneza – proces biologiczny podczas którego następuje formowanie zarodków z komórek wegetatywnych (somatycznych).

Czynniki wpływające: eksplantat, skład pożywki (w początkowym etapie konieczne są auksyny ), warunki kultury (ciemność)

Auksyny: 2,4 D, Picloram, Dicamba, niskie pH

Bezpośrednia somatyczna embriogeneza zachodzi wówczas gdy w eksplantatach znajdują sie komórki kompetentne do indukcji tego procesu.

Pośrednia somatyczna embriogeneza polega na tym, że zarodki formują się z komórek kalusa. Żywe komórki nie mające kompetencji do embriogenezy pod wpływem czynników kultury In vitro podlegają odróżnicowaniu do stanu merystema tycznego i w wyniku podziałów tworzy sie kalus (embrionalny). W obrębie kalusa powstają komórki kompetentne do rozpoczęcia somatycznej embriogenezy. W dalszych etapach w celu rozwoju zarodka z rośliny usuwa się z pożywki auksyny, dodaje cytokininy i wystawia na światło.

Zastosowanie kultur In vitro

- szybkie namnażanie identycznych genetycznie roślin, 80 mln szt sadzonek rocznie, w tym 90% to roślin ozdobne, producenci w Europie: Holandia, Francja, Polska, Niemcy.

- eliminacja patogenów i ułatwienie przewozu materiału roślinnego przez granicę (kultury merystemów)

- banki genotypów lub długie przechowywanie materiału roślinnego (temperatury chłodzone ok. 5⁰C lub zamrażane w ciekłym azocie)

- produkcja haploidów ( z gametofitu męskiego tj, z ziaren pyłku – androgeneza, z gametofitu żeńskiego, woreczka zalążkowego – ginogeneza

- uzyskanie mieszańców międzygatunkowych i międzyrodzajowych (przełamamie bariery niekrzyżowalności)

- indukcja mutacji, selekcja (możemy badać tolerancje suszy na stresy, na mróz, na zasolenie, zakwaszenie, odporność na choroby, herbicydy)

- produkcja metabolitów wtórnych i biotransformacje

- modyfikacja komórek roślinnych i transformacja.

Agrobiotechnologia jest częścią biotechnologii, która zajmuje się zastosowaniem metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej i zwierzęcej.

Cel biotechnologii

- genetyczne ulepszanie (modyfikacje genetyczne) znanych gatunków roślin i zwierząt oraz poszukiwanie nowych i wartościowych gatunków, które mogłyby po adaptacji wzbogacić grupę roślin uprawnych.

Modyfikacje genetyczne organizmów

- w obrębie jednego gatunku

- międzygatunkowe

Charakter modyfikacji

- zmiana aktywności genów naturalnie występujących w danym organizmie

- wprowadzenie do organizmu dodatkowych kopii jego własnych genów

- wprowadzanie do organizmu genów pochodzących z innych gatunków

Typy modyfikacji roślin

- odporność na herbicydy, owady, wirusy, choroby bakteryjne, niekorzystne warunki środowiska, poprawa cech jakościowych oraz użytkowych (wzbogacanie żywności, usuwanie substancji szkodliwych)

Głównym narzędziem modyfikacji genetycznych organizmów wykorzystywanych przez agrobiotechnologie są transformacje genetyczne.

Transformacja genetyczna – wprowadzenie do komórki (biorcy) fragmentów obcego materiału genetycznego (DNA), obejmujących jeden lub kilka genów.

Transfomant – komórka lub organizm powstały w wyniku transformacji genetycznej

Transgen – gen wprowadzany na zasadzie transformacji do komórki biorcy

Organizmy transgeniczne – transfomant i jego potomstwo dziedziczące transgeny.

Etapy transformacji

- izolacja genu (wyodrębnienie, zamrożenie oraz scharakteryzowanie określonego fragmentu DNA, klonowanie genu DNA w koloniach bakterii, amplifikacja DNA i technika PCR

- przygotowanie konstrukcji genowej (transgenu)

- wprowadzenie konstrukcji genowej do komórki roślinnej (metody wektorowe, bezwektorowe)

- regeneracja transgenicznych roślin

- identyfikacja i ocena transgeniczności

Konstrukt genowy musi zawierać

- gen strukturalny REP, SEL, PROM, Gen strukturalny, Terminator

- sekwencje regulującą jego funkcjonowanie: promotor (konstytutywny lub tkankowo specyficzny), terminator

- gen selektywny umożliwiający selekcje komórek, które uległy transformacji

- gen markerowy, selekcyjny

- gen reporterowy (wizualizujący)

Geny selekcyjne – ponad 40 genów służące do identyfikacji trans formantów np. geny odporności na antybiotyki, herbicydy, do rozkładu toksycznych wiązań chemicznych, stymulujące wzrost i rozwój In vitro, zdolność do rozkładów węglowodanów

Geny reporterowe – umożliwiające wizualizacje miejsc (tkanek i komórek) posiadających wprowadzony obcy DNA

- białka zielonej fluorescencji (GFP)

- białka lucyferazy

- białka beta-glukoromidazy (GUS)

Metody transformacji

- wektorowe – agroleacterium tumefaciens w sposób naturalny wprowadza swoje DNA do komórek roślin – plazmidy T1 i R1. Pozwala na wykorzystanie jej plazmidu jako wektora w tworzeniu roślin transgenicznych.

Rodzaje agroinfekcji

- za pośrednictwem kultur In vitro

- bez kultur In vitro – wprowadzenie inokulum bezpośrednio do tkanki roślinnej, w której odbywają się intensywne podziały komórkowe (nasiona)

Etapy transformacji In vitro

- inokulacja – umieszczenie eksplantatu (fragmenty tkanki) w płynnej zawiesinie bakteryjnej

- wstępne usunięcie nadmiaru bakterii, poprzez wypłukiwanie eksplantatu w wodzie lub pożywce i osuszenie na bibule

- konkultura – umieszczenie eksplantatu na pożywce z niezbędnymi składnikami – przeniesienie fragmentu tDNA do komórek biorcy

- umieszczenie eksplantatów na pożywce z antybiotykiem selekcyjnym co daje możliwość rozwoju wyłącznie komórek stransforowanych

- regeneracja roślin (w warunkach In vitro)

- identyfikacja tkanek zawierających DNA dawcy, za pośrednictwem genów re porterowych.

Czynniki wpływające na skuteczność agroinfekcji: gatunek rośliny, odmiana, linia będąca dawcą tkanki, rodzaj transformowanej tkanki, szczep bakteryjny wykorzystany do transformacji i stopień wirulencji, liczebność bakterii podczas inokulacji – czas kontaktu bakterii z tkanką roślinną, metodyka transformacji – sposób inokulacji, skład i pH pożywek, temperatura

Zalety i wady transformacji

- ochrona wprowadzonego genu (trans genu)

- duża wydajność (tylko dla roślin dwuliściennych)

- daje możliwości jednoczesnego wprowadzenia kilku szczepów bakterii zawierających różne geny

- metoda mało skuteczna w odniesieniu do roślin jednoliściennych

Infiltracja – polega na umieszczeniu homosfera? W stadium poprzedzającym zapłodnienie komórki jajowej w naczyniu napełnionym zawiesiną agrobacterium w warunkach niewielkiego podciśnienia.

- brak etapu regeneracji roślin – trans gen przekazywany jest d wszystkich komórek nowego organizmu - % zmodyfikowanych nasion/roślinę – 0,5 – 4%

- metoda stosowana u gatunków Bressica rapa, Brassica competsis, Brassica rapea.

Metody transformacji

1. Bezwektorowe

- transformacja protoplastów przy użyciu środków chemicznych, zwiększających przepustowość błony komórkowej (PEG – dla roślinnych protoplastów, chlorek wapnia – do bakterii

- mikrowstrzeliwanie – metoda biobalistycna przy wykorzystaniu bomby genowej

- metoda lipo frakcji – zamknięcie DNA w lizosomach (stosowana dla komórek roślinnych i zwierzęcych)

- wytrząsanie zawiesiny DNA z kryształkami węglika krzemu lub włókien szklanych

- elektroporacja – wspomaganie przenikania DNA impulsem elektrycznym (protoplasty)

- makro i mikroiniekcja (komórki rozrodcze i zarodkowe zwierząt)

Zalety i wady transformacji protoplastów

- możliwość uzyskania duzej liczby protoplastow

- otrzymanie kolonii komórkowych w wyniku podziału protoplastow

- klony

- mniejsza kinetyczność regenerowanych roślin (istnienie zarówno komórek transformowanych jak i nietransformowanych

- złożoność procedury

- problemy z regeneracja roslin – głównie jednoliściennych

Zalety i wady transformacji balistycznych

- możliwość zastosowania po transformacji wszystkich rodzajów tkanek

- niska wydajność transformacji

- niska przeżywalność Komorek transformowanych

- duża liczba wprowadzonych kopii trans genu

- wysokie koszty

Praktyczne zastosowanie roślin transgenicznych wymaga

- opracowanie efektywnej metody transformacji

- opracowanie efektywnej metody regeneracji

- kontroli ekspresji trans genu

Pierwsza odmiana pomidora transgenicznego Flaur Savr z 1994 roku. Inne przykłady to truskawki, a także rzepak zmodyfikowany.

Odporność roślin uprawnych na herbicydy uzyskano dzięki

- wprowadzeniu genu kodującego zmienioną formę enzymu, odporna na herbicyd

- wprowadzeniu genu kodującego enzym, który rozkłada herbicyd

- zwielokrotnirniu liczby genów kodujących enzym inaktywowany przez herbicyd

- odpornośc na owady – gen pochodzący z Bacillus thungensis koduje krystaliczne białko uszkadzające przewód pokarmowy owada.

- złoty ryż z wprowadzonymi genami umożliwiającymi produkcje beta-karotenu w endospermie i zwiększona zawartością żelaza

Roślinne szczepionki

Transgeniczna Salata wytwarzajaca szczepionke przeciwko wirusowemu zapaleniu watroby typu B, transgeniczny len – do włókien pozyskanych z lnu oleistego wprowadzono geny grzybów oraz z pewnych roślin z rodziny psiankowatych – dużo rosnących w Ameryce Płd.

Rośliny ozdobne – zmieniane cechy: barwa kwiatów, termin zakwitania, przedłużenie okresu wegetacji, przedłużenie trwałości kwiatów, pokrój roślin, aromat.

Bawełna – odporność na owady, Burak – niskokaloryczny cukier, cebula – tolerancja herbicydow, groch – odporność na owady, jęczmień – tolerancja herbicydow, zwiększenie zdolności browarnych.

Hodowla odmian genetycznie zmodyfikowanych – wytwarzanie konstrukcji genowej (inżynieria genetyczna).

Etapy:

- określenie celu (trudne do osiągnięcia naturalną metodą) – odporność na choroby, szkodniki, susze, zasolenie

- wybór odmiany do transformacji – odmiana dobrze znana i pozytywnie oceniana przez rynek

- wybór i wytwarzanie trans genu – wiedza o zależnościach pomiędzy fenotypami, rodzaj wektora, rodzaj genu selekcyjnego, wybór sposobu transformacji

- uzyskanie odmiany GM (pokolenie roślin, osobników transformowanych) – hemizygoty posiadają pojedyncza kopie trans genu), minimalna pula trans formantów gwarantujaca uzyskanie odmiany GM – 20-60

- ustalenie równoważności składnikowej i efektów niezamierzonych

- rejestracja i wprowadzenie odmiany GM do uprawy

Gatunki zmodyfikowane genetycznie

- soja (65,8 mln ha) – 53% wszystkich upraw

- kukurydza (37,3 mln ha) – 30%

- bawełna (15,5 mln ha) – 12%

- rzepak (5,9 mln ha) – 5%

Charakter modyfikacji genetycznych

- odporność na herbicydy – soja, kukurydza, rzepak, bawełna, koniczyna – 63%

- kilka różnych cech – 22%

- odporność na owady – 15%

1. USA – 63 mln ha – kukurydza, soja, bawełna, rzepak, koniczyna

2. Argentyna – 21 mln ha

3. Brazylia – 16 mln ha – obydwa soja, bawełna, rzepak

4. Indie i Chiny – 7,6 mln ha

Unijne i międzynarodowe uregulowania prawne dotyczące upraw GM

- polskie normy prawne

- rozporządzenia i dyrektywy UE

- konwencje międzynarodowe

- organizacje międzynarodowe WTO

- w Polskim prawie od 2001 o OMG, znowelizowana w 2003 roku (zamknięte użycie GMO, zakaz zamierzonego uwalniania GMO do środowiska, zakaz wprowadzenia do obrotu produktów GMO, wywóz za granice i tranzyt GMO, właściwości organów administracji rządowej do spraw GMO)

Podstawowe techniki i narzędzia biologii molekularnej stosowane w agrobiotechnologii

Enzymy restrykcyjne/endonukleazy

- enzymy bakteryjne, które stanowią część mechanizmu obronnego modyfikacji skierowanego przeciwko obcemu DNA

- rozcinają (hydrolizują) DNA na zdefiniowane i powtarzalne fragmenty

- rozcinają dwuniciowe fragmenty DNA w obrębie krótkich synetycznych sekwencji (4-8 nukleotydów)

- rozcinając pozostawiają tępe lub lepkie końce na fragmentach nici

- izoschizomery

- dwa enzymy mogą wytwarzać takie same lepkie końce mimo ,że rozcinają różne sekwencje DNA

- jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego objętość, która stanowi kawałek 1mg DNA

Podział

- długość - 4,6 i 8 nukleotydowe

- rodzaj generowanego produktu – tępe, lepkie końce 5’, lepkie końce 3’

Zastosowanie

- do celów analitycznych – technika southern

- do sekwencjonowania DNA i całych genomów

- do sporządzania biblioteki DNA

- do preparatyki DNA zrekombinowanego

Elektroforeza kwasów nukleinowych – zjawisko kinetyczne, w którym pod wpływem przyłożonego napięcia, makrocząsteczki obdarzone ładunkiem elektrycznym przemieszczającym się w polu elektrycznym. Technika stosowana do rozdziału, oczyszczania kwasów nukleinowych i białek. Jest swobodna, stabilizowana.

Prędkośc zależy od:

- wielkości cząsteczek

- oporu środowiska

- konferacji

- natężenia pola elektrycznego

- składu elektro wodorowego

Rodzaje nośników elektroforycznych

- bibuła

- azotan celulozy (płytki)

- agaroza (żel), polisacharyd otrzymany jest z glonów morskich rozpuszczony w roztworze wodnym tworzy staly zel

- poliakrylamid (polimer akrylamidu i bis akrylamidu – czynnik sieciujący)

Żele agarozowe

- 0,5 -4,0%

- łatwość przygotowania

- możliwość rozdziału bardzo dużych cząsteczek kwasów nukleinowych w przedziale wielkości od 50 do 30 000 pz

- mała wytrwałość mechaniczna

- trudność utrwalenia po rozdziale

Żele poliakrylamidowe

- 3,5 – 20%

- możliwość rozdziału cząsteczek kwasów nukleinowych w przedziale wielkości od 5 do 20 000 pz

- stosunkowo duża wytrwałość mechaniczna

- możliwość utrwalenia po rozdziale

Rodzaje elektroforezy

- kapilarna

- pozioma, horyzontalna

- pionowa. Wertykalna

Wizualizacja rozdzielanych fragmentów

- w żelu agarozowym – barwienie bromkiem etydyny

- w żelu poliakrylamidowym – barwienie bromkiem etydyny, azotanem srebra, fluoroscencyjnie wywoływanie izotopowe.

PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy – wykorzystywana do amplifikacji (namnażania) sekwencji DNA z udziałem pary oligonukleotydowych starterów z których każdy jest komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA. Jest to reakcja łańcuchowa, ponieważ każda nowo zsyntetyzowana nić jest matrycą do dalszej syntezy. Powielanie wybranego fragmentu DNA przeprowadza enzym polimeraza DNA izolowana z bakterii thermus aquaticus

Niezbędne składniki

- matryca – dwuniciowe DNA

- startery – para oligonukleotydowa o długości 10-30 pr do których dołączane są wolne nukleotydy podczas syntezy nowych nici DNA

- enzym – termo stabilna polimeraza DNA – polimeraza wyizolowana z bakterii

- wolne nukleotydy DTP

- jony pierwiastków dwuwartościowych np. MG²⁺

Każdy cykl reakcji obejmuje 3 etapy

- denaturacja dwuniciowej cząsteczki DNA w temp 93-95^oC

- przyłączenie startera w temp 35-60 (RAPD – 35-40)

- polimeryzacja (wydłużone) nici DNA w temp 70-72 (temperatura optymalna dla enzymu polimeraza DNA)

RT-PCR (odwrotna transkrypcja) – synteza nici DNA (Edna) komplementarnej do RNA przy użyciu startera oligo (dT) i enzymu odwrotnej transkryptazy: DNA> (transkrypcja)mRNA> (translacja)Białko

PCR w czasie rzeczywistym – pozwala określić poziom ekspresji genów, jeśli zachodzi to można określać różnice między nimi.

Zastosowanie techniki PCR

- wykrywanie i identyfikacja czynników chorobotwórczych

- selekcja właściwych genotypów

- określenie podobieństwa i różnic genetycznych

- określenie czystości odmianowej

- w medycynie sądowej

- badanie ekspresji genu

Zalety:

- wysoka specyficzność

- czułość

- szybkość

- możliwość zastosowania do wykrywania i identyfikacji patogenów bez konieczności izolacji czynnika wywołującego objawy chorobowe z zainfekowanej tkanki

Wymagania metody

- konieczność przynajmniej częściowej znajomości docelowej sekwencji DNA – zaprojektowanie odpowiednich starterów

Łańcuchowa reakcja polimerazy z arbitralnie wybranymi starterami (RAPD)

- jeden krótki 8-10 nukleinowy starter w losowej sekwencji

- niska temperatura przyłączenia startera (35-40^oC)

- wiele produktów reakcji których wielkość odpowiada odległości między sekwencjami komplementarnymi dla tych starterów

Zastosowanie:

- do identyfikacji patogenów grzybowych

- do zróżnicowania genetycznego

- do typowania genów danego gatunku (fragmentów DNA)

Klonowanie genów (molekularne) – w genetyce i biologii molekularnej to proces wyosobniania genu. Polega na łączeniu fragmentów materiału genetycznego z wektorem molekularnym i ich odmianami w innym organizmie. Otrzymuje siew ten sposób wiele kopii tego samego genu. Termin ten odnosi się do identyfikacji genów.

Schemat:

- izolacja DNA

- tworzenie badanego DNA i DNA wektorowego enzymem restrykcyjnym

- ligacja DNA badanego i DNA wektorowego w wyniku czego powstają tzw zrekombinowane czasteczki DNA

- wprowadzenie zrekombinowanych czastek DNA do bakterii E coli poprzez transformacje (mieszance bakterii w roztworze chlorku wapnia)

- namnozenie w Komorkach bakterii zrekombinowanych czasteczek DNA – bakterii po transformacji wysiewa się na pożywce agarowej do szalek Petriego – pożywka zawiera czynnik selekcyjny (antybiotyki)

- identyfikacja kolonii bakteryjnych zawierających zrekombinowana cząsteczkę DNA za pośrednictwem zawartego w wektorze?

Wektory do klonowania

- plazmidy – Male koliste czasteczki DNA występujące w Komorkach bakterii obok właściwego im genomu zdolne do autonomicznej niezależnej replikacji, Jako dodatkowy materiał genetyczny

Budowa

- miejsce ori – miejsce inicjacji replikacji

- gen odporności na antybiotyk, przeżycie na pożywce bez jakiegoś czynnika odżywczego

- lac z – enzym rozkładający cukier.

Bakteriofagi – wirusy, które infekują komórki bakteryjne, przekształcony jest w forme kulistą, rozpuszcza swój materiał genetyczny. DNA może ulegać replikacji, mogą tworzyć cząsteczki łagowe.

Kosmidy – zmodyfikowane plazmidy, wzbogacone o sekwencje cos umożliwiające wprowadzenie DNA kosmidu przez komorke bakteryjna.

Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) – cząsteczka liniowa do klonowania dużych DM

Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) – cząsteczka kolista do klonowania bardo dużych fragmentów DNA, wprowadzone fragmenty SA krótsze niż YAC, ale bardzo stabilne, łatwiej im transportować e-coli, namnażać i izolować.

Cechy wektora do klonowania

- krótkie czasteczki DNA, aby latwo się nimi manipulowalo w probowce

- wydajna replikacja wektora w komorce gospodarza (plazmidy lub bakteriofagi)

- wektor musi zawierać geny markerowe (które umożliwiają zidentyfikowanie komorki zawierające wektor aa odróżnienie czasteczek zrekombinowanych od niezrekombinowanych. Markerem może być gen odporności na antybiotyki, marker histochemiczny nadający komórce rozróżniajaca barwe, marker pokarmowy.

Materiał genetyczny wykorzystywany do klonowania

- całkowite DNA genomowe – biblioteka DNA

- cDNA – biblioteka cDNA (zawiera fragmenty DNA, pozbawione sekwencji niekodującej)

- produkt reakcji PCR

Biblioteka DNA – zespól fragmentów DNA danego organizmu połączonych z cząsteczkami wektorów w celu ich łatwiejszej analizy.

Cecha – 1 - 2

a) materiał wyjściowy – DNA – RNA

b) zawartość bibliotek – całość DNA komorkowego – odcinki cDNA odpowiadającego mRNA odczynu

c) badania biblioteki obejmuja – geny wraz z intronami fragmentów genów, odcinki DNA nie będące genami – cebulki kodujące pojedynczy gen

d) przydatność do stosowania w wektorach ekspresyjnych – niewielka – wysoka

e) stopien przygotowania – niski – wysoki

Zastosowanie klonowania molekularnego

- izolowanie genów i innych sekwencji DNA (do metod sekwencjonowania, hybrydyzacja z sondą)

- tworzenie zmodyfikowanych wersji genów do ponownego wprowadzania do organizmu w celu badania ekspresji genu i jego regulacji

- przenoszenie genów do innego organizmu w celu otrzymania dużych ilości białka kodowanego przez ten gen

Klonowanie organizmów – proces tworzenia organizmów mających taką samą informacje genetyczna jak dawca. Szczególnym przypadkiem jest twimming – czyli powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt nanozygotycznych, gdzie nie można wyróźnić danego genu.

- klonowanie oznacza procedure otrzymania organizmow o takiej samej informacji genetycznej z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra. W przypadku klonowania roślin stosuje się procedury odróżnicowania komórek dawcy do komórek merystema tycznych.

Hybrydyzacja – zdolność dwóch komplementarnych lub częściowo komplementarnych cząsteczek kwasów nukleinowych do tworzenia stabilnej hybrydy (DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA). Procesem odwrotnym denaturyzacji (oddzielenie się pojedynczych nici) jest renaturyzacja.

Ze względu na sposób można podzielić:

- hybrydyzacja w roztworze

- hybrydyzacja In situ – lokalizacja genu na chromosomie

- hybrydyzacja na podłożu stałym.

Ze względu na rodzaj badanego materiału genetycznego na podłożu stałym:

- typu southern (obiekt badań DNA)

- typu northern (RNA)

- typu kropkowa (DNA, RNA)

- typu kolonijna (DNA)

- typu western (białka)

Sonda molekularna – wstrzykiwanie cząsteczki DNA i sekwencji komplementarnej do sekwencji docelowego DNA, który chcemy wykryć sondą , może być syntetyczny oligonukleotyd lub sklonowany fragment DNA.

- znaczniki – promieniotwórcze, fluoroscencyjne, alkaliczne, chemiluminescencyjne

Hybrydyzacja typu southern

- trawienie genomowego DNA enzymami restrykcyjnymi

- elektroforeza w żelu agarowym uzyskanych produktów trawienia o różnej długości DNA

- transfer (przemieszczenie) stworzonych fragmentów DNA z żelu na błonę rybozową

- inkubacja błony z sondą molekularną – hybrydyzacja sondy do komplementarnych fragmentów DNA znajdujących się na błonie

- detekcja

- wizualizacja – na kliszy rentgenowskiej

Zastosowanie:

- do wykrywania czynników chorobotwórczych

- do identyfikacji liczby kopii danej sekwencji

Hybrydyzacja typu Northern:

Zastosowanie:

- do identyfikacji rejonów ulegających transkrypcji

- do porównania ekspresji określonych genów na poziomie transkrypcji w kilku lub kilkunastu badanych próbach o różnym pochodzeniu (różne tkanki)