Metoda molekularna

testy oparte na wykrywaniu RNA. Najczęściej stosuje się różne modyfikacje techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR):

• RT-PCR

• IC/RT-PCR

• mRT-PCR

• Real-Time PCR

Testom diagnostycznym stosowanym w ocenie zdrowotności materiału roślinnego stawia się następujące wymagania:

1. Specyficzność – test musi wykrywać konkretnego wirusa, często spośród innych jemu towarzyszących; nie może wchodzić w reakcję z innym materiałem roślinnym.

2. Czułość – zdolność do wykrywania wirusa w niskiej koncentracji.

3. Szybkość – testowanie nie może trwać zbyt długo, szczególnie na granicy.

4. Pewność (unifikacja) – musi gwarantować powtarzalność (porównywalność) wyników bez względu na to kto je wykonuje.

5. Prostota – możliwe do opanowania przez kadrę techniczną.

6. Niski koszt – powinny stanowić sensowną część kosztów produkcji danej rośliny.

Występowanie i rozprzestrzenianie wirusów

Obserwacje z ostatnich lat wskazują na gwałtowny wzrost liczby nowych gatunków wirusów i nowych miejsc ich występowania.

W roku 1991 rejestrowano ok. 380 gatunków wirusów a w roku 2005 ponad 900, nie licząc wariantów genetycznych i patotypów w obrębie gatunków.

Na podstawie literatury za okres 1996-2002, w ponad 51% przypadkach nowych porażeń roślin jako czynnik chorobotwórczy zidentyfikowano wirusy i fitoplazmy.

Ponad 77 % porażeń wirusowych występowało na roślinach uprawnych i tylko 6% na roślinach dziko rosnących co przypisuje się głównie zawleczeniu z importowanym materiałem roślinnym.

Tylko w Zakładzie Wirusologii i Bakteriologii IOR, w ostatnich 10 latach zidentyfikowano ponad 20 nowych wirusów, nie licząc nowych szczepów i patotypów.

1. Globalizacja = zwiększona mobilność ludności wymiana handlowa

Drogi przenikania i rozprzestrzeniania:

-legalna wymiana materiału roślinnego propagacyjnego

rośliny i nasiona; słabym punktem jest ocena zdrowotności nasion:

(a) państwa importujące często nie posiadają technik diagnostycznych

dla nowych wirusów,

(b) wyniki testowania nie zawsze są jednoznaczne

-import materiału roślinnego dla celów przemysłowych

i spożywczych – kontrola fitosanitarna ograniczona

-nielegalne przewożenie materiału roślinnego – poza

kontrolą fitosanitarną

2. Zmiany klimatyczne i pogodowe

Nie jest jasny bezpośredni wpływ na wirusy ani gwałtownych zmian pogody ani nieznacznego ocieplenia klimatu.

Zmiany pogodowe z pewnością wpływają na rozprzestrzenianie się wirusów poprzez bezpośredni wpływ na owadzie wektory.

W latach 1998-2007 wiosenne naloty podstawowych gatunków mszyc ziemniaka takich jak M. persicae i A. nasturtii były wcześniejsze, odpowiednio 32 i 14 dni niż w okresie wcześniejszym.

Inna nowa jakość w epidemiologii PVY jest związana z istotnym wzrostem roli mszyc nie związanych pokarmowo z ziemniakiem, wynikająca ze wzrostu ich liczebności, wcześniejszej migracji wiosennej niż mszyce ziemniaczane i efektywnego przenoszenia wirusów (Kostiw, Robak 2009; Kostiw, Robak 2008).

W ograniczaniu występowania chorób wirusowych nadal nie dysponujemy środkami chemicznymi bezpośrednio działającymi przeciwko wirusom.

Strategia ograniczania występowania chorób wirusowych faktycznie sprowadza się do zabezpieczania roślin przed infekcją wirusową (biosecurity).

Szczególną rolę w działaniach chroniących roślinę przed wirusami odgrywa identyfikacja i wykrywanie wirusów z zastosowaniem odpowiednich technik diagnostycznych.

Techniki molekularne stosowane w identyfikacji i wykrywaniu wirusów

Do masowego wykrywania wirusów nadal najczęściej stosuje się test enzymoimmunologiczny (ELISA). Obecnie jest to test w znacznym stopniu zautomatyzowany i wystarczająco czuły szczególnie w wykrywaniu wirusów w materiale roślinnym. Ograniczeniem dla tego testu jest wymagana wysoka specyficzność surowicy oraz zbyt niska czułość testu względem wirusów w niskiej koncentracji. Ograniczenia te usuwają testy molekularne oparte na wykrywaniu RNA lub DNA technikami PCR bądź real-time PCR.

1. Odwrotna transkrypcja i reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-PCR)

+ czuła - pracochłonna = izolacja RNA,

+ specyficzna - wizualizacja produktu RT-PCR

Technika przydatna do identyfikacji wirusów w masowej diagnostyce do ograniczonej liczby prób i często wspiera test ELISA w wątpliwych przypadkach.

2. Multiplex RT-PCR (mRT-PCR)

Jednoczesne stosowanie 2-3 różnych par starterów daje możliwość jednoczesnego wykrywania 2-3 wirusów w jednej reakcji.

3. Serologiczne wyłapywanie i RT-PCR (IC-RT-PCR)

+ nie ma potrzeby izolacji matrycy (RNA)

+ 200-300 razy czulsza niż RT-PCR

- wizualizacja otrzymanego produktu PCR

4. Bezpośrednie wyłapywanie i RT-PCR (DB-RT-PCR)

+ nie jest potrzebna surowica

+ nie ma potrzeby izolacji RNA

- wizualizacja produktu

Obie techniki są przydatne w masowym wykrywaniu.

5. RT-PCR w czasie rzeczywistym (real-time RT PCR)

+ szybka

+ najczulsza

+ produków reakcji nie trzeba wizualizować

• trzeba izolować RNA

• dobór odpowiednich starterów

6. Serologiczne wyłapywanie i real-time PCR (IC real-time RT PCR)

+ j.w.

+ nie trzeba izolować RNA

+ masowe testowanie (96 prób-jedna płytka)

• posiadanie surowicy wysokiej jakości

Wirusy są przenoszone przez nasiona na dwa sposoby:

1. Na powierzchni nasion (kontaminacja):

- wirusy trwałe

- koncentracja wirusa na nasionach przypadkowa, często wysoka

- możliwość inaktywacji wirusa

2. W zarodku

- przenoszenie warunkowane genetycznie

- koncentracja wirusa w zarodku zależy od wirusa, szczepu, gatunku i odmiany rośliny, często bardzo niska

- inaktywacja wirusa utrudniona lub niemożliwa

Ok. 30% wirusów jest przenoszonych przez nasiona. Nasiona skażone wirusami są najsłabszym ogniwem w kontroli rozprzestrzeniania się wirusów.

Sposoby wykrywania wirusów w/na nasionach:

1. Bezpośrednio w nasionach (w maceracie nasion)

2. W kiełkach lub siewkach

3. W 4 – 6 tygodniowych sadzonkach

Dobór sposobu i techniki wykrywania zależy od układu wirus – roślina

Problemy:

1. Techniki molekularne są kosztowne: specjalistyczna aparatura i wysokiej jakości odczynniki.

2. Powinny być wykonywane w odpowiednich warunkach laboratoryjnych.

3. Problemy z interpretacją wyników. Wysoka czułość niesie ze sobą niebezpieczeństwo otrzymywania wyników fałszywie pozytywnych lub fałszywie negatywnych.

4. Wiarygodność wyników w dużym stopniu zależy od właściwie zaprojektowanych starterów. Muszą one wykrywać wszystkie szczepy danego wirusa.

5. Techniki molekularne (i serologiczne) wykrywają zarówno infekcyjne jak i

nieinfekcyjne cząstki wirusowe. Nie oddaje to faktycznego stanu

fitosanitarnego testowanego materiału roślinnego. Często rodzi to konflikt

pomiędzy firmą nasienną a nabywcą nasion i służbami fitosanitarnymi.

6. Potrzeba równoczesnego stosowania technik molekularnych i biotestów czyni diagnostykę bardziej pracochłonną i kosztowniejszą ale uzyskane wyniki pełniej charakteryzują stan fitotosanitarny nasion.

7. Do każdego przypadku należy dopracować warunki wykonania testu (jaka wielka próba, rozcieńczenie, kiedy pobierać próby, dobór startera, sprawdzenie warunków reakcji)

8. Jak pogodzić czas testu z wiarygodnością wyników.