Konspekt ćw 1.

Komórka składa się z:

• otoczki,

• ściany komórkowej,

• błony cytoplazmatycznej,

• rzęski,

• fimbrii,

• cytoplazmy,

• rybosomów,

• nukleoidu.

Ściana komórkowa bakterii jest elastyczną strukturą nadającą komórce określony kształt. Stanowi barierę ochronną przed czynnikami zewnętrznymi, jest przepuszczalna dla substancji niskocząsteczkowych i soli mineralnych. Szkielet ściany komórkowej bakterii składa się z polimeru – peptydoglikanu, zwanego mureiną. Peptydoglikan składa się z łańcuchów polisacharydowych, usieciowanych przez mostki peptydowe. Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomureinowego połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym. Białka umieszczone w zewnętrznej warstwie ściany komórkowej różnią się w zależności od rodzaju i szczepu bakterii.

• Ściana komórkowa bakterii Gram-dodatnich jest zbudowana z 40 warstw mureiny. Chemicznie około 30-70% suchej masy ściany stanowi peptydoglikan. W strukturze peptydoglikanu występują kwasy tejchojowe i lipotejchojowe. Ścianę komórkową bakterii Gram-dodatnich można usunąć za pomocą enzymu – lizozymu, naturalnie występującego w łzach i błonach śluzowych jamy nosowej. Komórkę Gram-dodatnią po usunięciu ściany komórkowej nazywamy protoplastem.

• Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych składa się zaledwie z 2-3 warstw mureiny, co stanowi około 10-20% (peptydoglikan). Otoczona jest zewnętrzną błoną złożoną z lipopolisacharydów, fosfolipidów, lipoproteidów i białek. Fosfolipidy występują głównie w wewnętrznej warstwie zewnętrznej błony, a lipoproteidy łączą zewnętrzną błonę z peptydoglikanem. Warstwa lipopolisacharydowa zawiera duże ilości jonów wapnia, co czyni ją odporną na działanie lizozymu. Komórki bakterii Gram-ujemnych o usuniętej ścianie komórkowej nazywamy sferoplastami.

• Otoczka – cienka warstwa, śluzu która pokrywa komórki wszystkich gatunków bakterii, ułatwia wymianę składników w układzie komórka-środowisko. U niektórych gatunków warstwa śluzu ulega pogrubieniu, tworząc wyraźny szczegół struktury morfologicznej komórki. Chroni bakterie przed wysychaniem i fagocytozą, umożliwia adhezję oraz zwiększa jej chorobotwórczość.
  Pod względem chemicznym otoczki u większości gatunków zbudowane są z wielocukrów, u niektórych z polipeptydów. W obydwu przypadkach związki te mają właściwości antygenowe i w warunkach zakażenia wyższy ustrój odpowiada na nie wytworzeniem swoistych przeciwciał, które wykrywa się za pomocą odczynów serologicznych (serologia) wykonywanych w ramach badań diagnostycznych.

 

• Błona cytoplazmatyczna – jest położona pomiędzy ścianą komórkową a cytoplazmą. Zbudowana jest z białka i fosfolipidów. Błona pełni funkcję transportową przepuszczając substancje odżywcze do wnętrza komórki i wydalając zbędne metabolity. Transport ten może się odbywać na drodze pasywnej, zgodnie z gradientem stężeń lub aktywnej wbrew gradientowi stężeń z wykorzystaniem energii oraz enzymów – permeaz.

• Rzęski – to zewnątrzkomórkowe struktury odpowiadające za ruch bakterii. Najczęściej spotykane są wśród bakterii spiralnych i cylindrycznych. Zbudowane są z białka kurczliwego – flagelliny i zakotwiczone są w cytoplazmie, błonie i ścianie komórkowej za pomocą haczyka i ciałka podstawowego (bazalnego). Liczba i rozmieszczenie rzęsek ma znaczenie taksonomiczne

Typy urzęsienia bakterii:

1. bezrzęse, B) monotrichalne, C) amfitrichalne, D ) lofotrichalne, E ) ditrichalne F) peritrichalne

Fimbrie (pile) – to zewnątrzkomórkowe wypustki cytoplazmatyczne, krótsze niż rzęski. Zbudowane głównie z niekurczliwego białka. Wyróżnia się dwa typy fimbrii – pospolite, umożliwiające adhezję komórki i płciowe (pilusy) biorące udział w procesie koniugacji. Występują głównie u bakterii Gram-ujemnych.

Cytoplazma – wypełnienie komórki, w którym zawieszone są organelle wewnątrzkomórkowe. Składa się w 80% z wody i substancji organicznych. Stanowi środowisko reakcji enzymatycznych.

Rybosomy – organelle zawieszone w cytoplazmie, biorące udział w syntezie białek. W komórkach prokariotycznych występują rybosomy 70S składające się z dwóch podjednostek 30S i 50S. Zbudowane są głównie z RNA. W cytoplazmie mogą tworzyć skupiska zwane polisomami.

Nukleoid – to materiał genetyczny (genom) w postaci DNA, w którym znajduje się informacja genetyczna odnośnie podstawowych funkcji życiowych komórki bakterii. Nukleoid jest zakotwiczony w błonie cytoplazmatycznej lub w ścianie komórkowej.

Przetrwalniki – zdolność wytwarzania przetrwalników posiadają laseczki czyli bakterie Gram-dodatnie, cylindryczne z rodzajów Bacillus i Clostridium. Przetrwalniki są to formy przetrwalne bakterii, które tworzą się w niekorzystnych warunkach środowiska w procesie sporulacji wewnątrz komórki bakteryjnej. Typ przetrwalnikowania (Rys. 10) jest cechą diagnostyczną (u laseczek Bacillus sp. przetrwalnik nie deformuje komórki, a deformuje u laseczek Clostridium sp.). Przetrwalnik zbudowany jest z rdzenia stanowiącego cytoplazmę otoczoną błoną cytoplazmatyczną, ścianą komórkową oraz korteksu (kory).

 

Wyróżniamy:

• Szczepy wytwarzające barwniki związane z komórką, nie dyfundujące do podłoża np. Micrococcus, Staphylococcus

• Szczepy wytwarzające barwniki niezwiązane z komórką, dyfundujące do podłoża np. Pseudomonas

Posiewane mikroorganizmy określa się mianem inokulum.

Różne mogą być cele posiewu, a więc i założonej hodowli:

• wyizolowanie określonych drobnoustrojów z prób środowiskowych (wody, gleby), w tym uzyskanie czystych szczepów, czyli zbiorów komórek pochodzących z jednej komórki macierzystej, z zamiarem ich dalszych badań (m.in. identyfikacji),

• namnożenie komórek już wyizolowanego i zidentyfikowanego szczepu, np. w celu pozyskania pewnych produktów jego metabolizmu, lub zbadania jego zdolności do rozkładu określonych zanieczyszczeń, policzenie komórek wchodzących w skład posiewanej próby.

• Na szczególną uwagę zasługuje zapotrzebowanie na źródło energii i węgla. W przypadku mikroorganizmów autotroficznych źródłem energii jest promieniowanie słoneczne (fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych związków nieorganicznych (chemoautotrofy), źródłem węgla natomiast obecny w atmosferze CO₂. Dlatego pożywki do hodowli autotrofów nie muszą zawierać związków węgla.

•   Dla heterotrofów natomiast źródłem energii i węgla są związki organiczne. Pod względem zapotrzebowania na związki organiczne mikroorganizmy dzieli się na dwie grupy:

• prototrofy, wymagające do wzrostu tylko jednego rodzaju związku węgla,

• auksotrofy, wymagające przynajmniej dwóch rodzajów związków węgla.

W mikrobiologii stosuje się różne rodzaje pożywek, w zależności od celu badań. Ze względu na konsystencję można je podzielić na:

• płynne,

• stałe,

• półpłynne.

Inny podział pożywek uwzględnia wymagania odżywcze drobnoustrojów:

• pożywki proste,

• pożywki wzbogacone,

• pożywki specjalne,

• pożywki wybiórcze (selektywne),

• pożywki wybiórczo-namnażające,

• pożywki wybiórczo-różnicujące

Pożywki dzieli się też na:

• syntetyczne (o ściśle zdefiniowanym składzie ilościowym i jakościowym),

• naturalne (o nie znanym dokładnie składzie, na bazie składników pochodzenia naturalnego, np. wyciąg z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, krew, mleko itp.),

• półsyntetyczne (pożywka mineralna o znanym składzie, plus składniki pochodzenia naturalnego, o nie sprecyzowanym dokładnie składzie).

Punkty kardynalne są podstawą do podziału mikroorganizmów na trzy podstawowe grupy:

• psychrofilne (zimnolubne), o temperaturze optymalnej ok. 20⁰C (minimum ok. -10⁰C, maksimum ok. 30⁰C),

• mezofilne (średniotemperaturowe), o optimum w 37⁰C (minimum 15⁰C, maksimum 45⁰C),

• termofilne (ciepłolubne), o optimum w 55⁰C (minimum 30⁰C, maksimum 75⁰C).

Większość bakterii preferuje odczyn obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 – 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku kwaśnym (pH ok. 5,2 – 5,6).

Pod względem stosunku do tlenu mikroorganizmy dzieli się na:

• Bezwzględne tlenowce (bezwzględne aeroby)-21% O₂

• Bezwzględne beztlenowce (bezwzględne anaeroby)- mniej niż 1-0,5% O₂

• Względne beztlenowce (względne anaeroby),

• Mikroaerofile.-5-15% O₂₍mieszanina 5% O_2, 10% CO_2, 85% N₂₎

Większość drobnoustrojów może rosnąć tylko przy określonym stężeniu soli, w roztworze izotonicznym (stężenie soli na zewnątrz i wewnątrz komórki są sobie równe). Komórki w roztworze hipotonicznym, gdy stężenie soli na zewnątrz komórki jest mniejsze i woda ma tendencje do wnikania do wnętrza, mogą ulec pęknięciu (dzięki ścianie komórkowej udaje im się jednak wytrzymać określony napór wody). Z tego powodu do rozcieńczania prób w mikrobiologii nie stosuje się wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny będący 0,85% roztworem NaCl.

Hodowle dzieli się zwykle na:

• statyczne (okresowe),

• ciągłe,

• zsynchronizowane.

W hodowli statycznej mikroorganizmy posiane do pożywki rosną i rozmnażają się do czasu wyczerpania się składników pokarmowych lub (i) nagromadzenia się toksycznych produktów przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji bakterii przebiega w kilku charakterystycznych fazach, które można zobrazować na wykresie w postaci tzw. krzywej wzrostu:

• faza zastoju,

• faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),

• faza stacjonarna,

• faza zamierania.

Jeśli tylko zapewni się usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Na tym właśnie polega hodowla ciągła. Jest więc ona, w przeciwieństwie do hodowli statycznej, układem otwartym, z ciągłym przepływem pożywki (zużytej i świeżej).

Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w której komórki dzielą się równocześnie (czyli synchronicznie), w przeciwieństwie do innych hodowli, gdzie podziały komórek są nieskoordynowane. Dzięki jednoczesności podziałów, zmiany w hodowli synchronicznej są odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komórce. Umożliwia to badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle nieuchwytnych ze względu na zbyt małą czułość metod badawczych.

Celem posiewu redukcyjnego jest wyizolowanie czystych szczepów drobnoustrojów w postaci kolonii. Czysty szczep to zbiór komórek pochodzących od jednej komórki macierzystej. Posiew izolacyjny, zwany też redukcyjnym, polega na rozprowadzaniu zawiesiny komórek za pomocą ezy, po powierzchni pożywki agarowej. W miarę przeciągania ezy po pożywce, liczba drobnoustrojów przenoszonych na powierzchnię podłoża będzie coraz mniejsza, aż w końcu na oczku ezy pozostaną nieliczne komórki, które będą się pojedynczo przyklejać do pożywki. Każda z tych oddzielonych od siebie komórek zacznie się dzielić i utworzy odrębną kolonię – wyizolowany czysty szczep.

Wyróżniamy następujące sposoby barwienia bakterii:

• proste, w których preparat barwi się przy pomocy jednego barwnika i wszystkie bakterie są zabarwione podobnie

• barwienie złożone, w których używa się wielu barwników i bakterie reagują na różne barwniki w innych sposób

• Barwienie pozytywne polega na zabarwieniu w preparacie komórek drobnoustrojów, zaś barwienie negatywne opiera się na uwidocznieniu otoczenia, nie zaś obiektu. W dobrze wybarwionym preparacie „pozytywnym” będziemy obserwować obiekt na jasnym tle, natomiast w preparacie „negatywnym” wybarwia się tło, a komórki pozostają jasne.

• Barwienie proste pozytywne

• Przed rozpoczęciem barwienia należy przygotować i utrwalić preparat. Preparat wykonuje się poprzez rozprowadzenie zawiesiny bakterii na szkiełku podstawowym, które następnie suszy się na powietrzu. Utrwalenia materiału dokonuje się za pomocą czynników fizycznych (ogrzewanie szkiełka z suchym preparatem w płomieniu palnika gazowego, umieszczenie w temp. 60^oC przez 10 min) lub chemicznych (alkohol etylowy, metylowy, formalina, pary kwasu osmowego). Utrwalenie materiału ma na celu zabicie obecnych w nich mikroorganizmów, a tym samym ułatwienie wnikania barwnika do ich wnętrza. Utrwalenie powoduje denaturacje enzymów bakteryjnych, co zapobiega rozkładaniu przez nie struktur komórkowych tzw. autolizie. Utrwalenie zwiększa również przyczepność komórek drobnoustroju do szkiełka podstawowego.

• Barwienie proste negatywne

• Technika barwienia negatywnego wybarwia tło preparatu. Bakterie pozostają jasne widoczne na zabarwionym tle. Bakterie nie ulegają zabarwieniu podczas barwienia negatywnego, gdyż zachodzi zjawisko odpychania się jonów ujemnie naładowanych. Zarówno bakterie jak i kwaśne barwniki posiadają jony ujemne. Procedura barwienia negatywnego nie wymaga wysokich temperatur ani mocnych środków chemicznych utrwalających preparat, dzięki czemu komórki poddane barwieniu pozostaną stosunkowo niezmienione. Technika barwienia negatywnego jest więc przydatna do określenia morfologii i rozmiaru mikroorganizmów, gdy inne techniki okazują się niewystarczające.

Barwienie złożone:

-Grama

-Ziehl-Neelsena

-Neissera

-Schaeffer-Fultona

-Barwienie pozytywno-negatywne-OTOCZKA

Identyfikacja bakterii:

1.Testy API (cechy biochemiczne):

Sprawdzanie właściwości biochemicznych drobnoustrojów jest jednym z etapów diagnostyki mikrobiologicznej. Badania te przeprowadza się na specjalnych podłożach diagnostycznych lub podłożach wybiórczo-diagnostycznych. W badaniach tych wykorzystuje się najczęściej reakcje kataboliczne, tj. zdolność do rozkładu substratów za pomocą enzymów komórkowych. Produkty tych reakcji wykrywa się za pomocą wskaźników, odczynników lub specjalnych testów.

2. Metody immunologiczne (aglutynacja)

3.Metody mikroskopowe

4. Metody molekularne

5.Systemy automatyczne