Rośliny modyfikowane genetycznie - cele modyfikacji
Zmodyfikowane zostało większość roś mających znaczenie dla człowieka.
Cele modyfikacji to:
- odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roś (np. soja rzepak)
- odporność na szkodniki - modyfikacja BT (Bacillus Thuringensis) (np. kukurydza, bawełna)
- odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne (chitynaza, glukanaza, osmotyna, białka płaszcza wirusa, replikazy, proteazy)
- odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenia gleby, mróz, susza, metale ciężkie)
- poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych (pomidor Flavor Savr, Golden Rice, szczepionki w warzywach)
Pierwsza genetycznie modyfikowana roślina to pomidor.
Pomidory zbierane jeszcze przed osiągnięciem fazy dojrzewania. W takich zielonych pomidorach nie zakończona jest synteza cukrów, dlatego były spryskiwane etylenem.
Flavor Savr
- są zbierane czerwone, bo tam wprowadzony jest odwrotny gen poligalakturonazy (PG) w orientacji antysensownej,
- RNA powstałe do transkrypcji odwróconego genu łączyło siękomplementarnie z mRNA prawidłowego genu PG.
- Rybosom nie mógł się przyłączyć - brak syntezy. Zablokowany jest enzym który powoduje że owoce nie miękną.
- Wprowadzony w '94 w Stanach Zjednoczonych.
Złoty ryż - Potrkus- twórca
- ma 20x więcej B-karotenu
- wprowadza 2 geny: syntezy fitoenu (psy) i desturazę karotenu (crtl) - są to enzymy uczestniczące w syntezie B-karotenu.
- zwiększona zawartość żelaza - wprowadzono geny ferrytyny (przyswajanie Fe)
Większość białek rekombinowanych:
1.Komórki zwierzęce:
a)zalety:
- prawidłowa obróbka potranslacyjna
b)wady:
- niska wydajność
- wysoki koszt utrzymania bioreaktorów
- wrażliwość kultury
2.Komórki mikroorganizmów
a)zalety:
- większa wydajność
b)wady:
- wymaga obróbki białek
- wysoki koszt oczyszczania
- wysoki koszt utrzymania bioreaktorów
- wrażliwość kultury
3.Rośliny:
a)zalety:
- prawidłowa obróbka potranslacyjna
- niski koszt
- eliminacja porażenia patogenami
- pochodzenia zwierzęcego
Molecular farming - produkcja białek przez rośliny, które moają właściwości farmakologiczne. Mogą być wykorzystywane w przemyśle, rolnictwie, weterynarii, medycynie
Wykorzystywanie roślin do wytwarzania biofarmaceutyków:
- koszt jest o wiele niższy
- w porównaniu z białkami przy użyciu E.Coli jest 50x niższe
- jeżeli chodzi o kultury zwierzęce to nawet 1000x koszty mogą być obniżone
Farmaceutyki uzyskane w komórkach roślinnych:
- Np. ludzka albumina osocza (HSA) - nieglikozydowe białko, zapotrzebowanie 550t rocznie
Produkcja przeciwciał o właściwościach terapeutycznych w roś:
- 1-akrowe (63m x 63m) poletka kukurydzy daje tyle samo przeciwciał co 100,000 litrów komórek (ponad 6 ogromnych bioreaktorów, czyli ok. 18kg przeciwciał na rok)
- roślinne przeciwciała mogą kosztować na rynku od $0,1 do $1 za gram, te z kultur komórkowych kosztują teraz $200-$650 za gram (kultury tkankowe)
- Np. chimeryczne przeciwciało powierzchniowemu antygenowy Streptococcus mutans - slgA przeciwciała uzyskane z tytoniu zaaplikowano nazębnie, przeciwciała te chroniły zęby przed kolonizacją Streptococcus mutans
Materiał szczepionkowy stanowią:
- inaktywowane (zabite) mikroorganizmy
- osłabione (atenuowane) - na drodze mutacji wstrzykuje się, b.efektywne, większa odporność, niebezpieczeństwo, to to że mogą powodować alergie, stany zapalne.
Szczepionki rekombinowane:
Materiałem szczepionkowym są pojedyncze antygeny, w przypadku wirusów jest to najczęściej białko otoczki. Uzyskuje się je w wyniku ekspresji genu kodującego właściwe białko antygenowe w sposób, który pozwala zachować jego immunogenność. Białko musi być aktywne (zachowywać swoją immunogenność)
Antygen - każda substancja, która wzbudza przeciwko sobie odpowiedź swoistą
Wytwarzanie szczepionek w roślinach transgenicznych:
1.Izolacja genu kodującego białko antygenowe mikroorganizmu chorobotwórczego
a)A.Tumefaciens rozbrojony
b)transformacje genetyczne
2.Rośliny transgeniczne wytwarzają białko antygenowe mikroorganizmu chorobotwórczego
a)rośliny transgenicznie
3.Rozmnażamy je klonalnie
a)albo izolacja i oczyszczenie antygenu i tradycyjne szczepienie (bardziej kosztowne)
b)albo immunizacja na drodze pokarmowej poprzez bezpośrednią konsumpcję
Wytwarzanie antygenów w zrekombinowanych wirusach roślin:
1a.Antygen z organizmów patogenicznych
2.Fragmenty DNA kodujące epitop
1b.Epitop - fragment antygenu bezpośrednio łączy się z przeciwciałem
3.Połączenie sekwencji kodującej epitop z genem otoczki wirusa (2+1b) - epitop później był produkowany przez rośliny na powierzchni wirusa
4.Infekcja roślin gospodarza zmodyfikowanym wirusem, wytwarzającym białka antygenowe
5.Produkcja antygenów:
a)mozaika kalafiora - rośliny zmodyfikowane zrekombinowanym wirusem, szczepionka jadalna
b)tytoń - izolacja i oczyszczenie chimeralnych cząstek wirusa
6.Immunizacja ludzi i zwierząt
W zrekombinowanych wirusach roślinnych:
- od kilku do kilkunastu % białka antygenu (wyprodukowane w zrekombinowanych roślinach)
- czasem następuje odrzucenie epitopu z wirusa roślinnego
Szczepionki uzyskiwane w roś - jadalne szczepionki, modyfikowana sałata, produkcja szczepionek na zapalenie wątroby typu B - została opracowana przez inst.Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu.
Zalety i wady roślinnych biofarmaceutyków:
1.Zalety:
- posiadają one eukariotyczne szlaki syntezy białek
- nie ma możliwości zanieczyszczenia ludzkimi lub zwierzęcymi patogenami
- systemy roślinne są bardziej ekonomiczne niż technologie bioreakcyjne
- duża skala
- zdolność kompletnej immunizacji ogólnoustrojowej szczepionek doustnych
- etap oczyszczania pominięty, jeżeli białko przyjmowane doustnie
- ilość białek rekombinowanych osiąga w roślinie poziom produkcyjny, nawet do 14%
2.Wady:
- czas wymagany do uzyskania linii roślin transgenicznych wykazujących stałą ekspresję pożądanego genu (kilka, kilkanaście lat)
- małą wiedza dotycząca procesu oczyszczania zrekombinowanych białek
Produkcja GMO w 2005
Powierzchnia upraw 96-05 - cały czas wzrost, obecnie ok. 90 mln ha na świecie to uprawiane na tej powierzchni rośliny GMO
Kraje o njawiększym areale upraw GMO 2005 (powyżej 50 tyś ha)
1.USA - ok. 50 mln ha GMO roś, głównie soja, kukurydza, bawełna, rzepak, papaja
2.Argentyna - 17 mln ha, soja, kukurydza, bawełna
3.Brazylia - 9,4 mln, soja
Europa:
Hiszpania, Portugalia, Francja, Czechy = 0,1 mln
Kukurydza:
- GA21 wprowadzono gen odporności na herbicyd - substancję czynną glifosat, jako pasza i do celów żywnościowych dopuszczona
- Kukurydza + gen spec.turingensis - wprowadzono gen warunkujący odporność na szkodniki, na paszę
Polska:
GMO nie wpisuje się do krajowego rejestru, nie można uprawiać, nie można sprowadzać materiału siewnego i nasion na paszę.
Globalny wzrost upraw GMO '96-`-05
- soja, najwięcej - odporność na herbicyd (raundap)
- kukurydza, bawełna - odporność na szkodniki
- rzepak - poprawienie składu kwasów tłuszczowych
Udział odmian transgenicznych (w %) w globalnym areala w '05 roku:
60% soi to odmiany GMO
28% bawełna
18% rzepak
14% kukurydza
Zwierzęta modyfikowane genetycznie
Terminem zwierze transgeniczne określa się takie zwierzę, które w swoim genomie posiada egzogenny DNA w postaci:
- losowego zintegrowanego fragmentu liniowego DNA
- zmodyfikowanego własnego genu w wyniku wprowadzenia egzogennego DNA (technologia knock-out)
- wprowadzenie całej sztucznej jednostki genetycznej np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC lub sztucznego chromosomu YAC
Metody otrzymywania zwierząt genetycznie modyfikowanych:
1.Metody bezwektorowe:
- mikroiniekcja DNA do zygoty
- modyfikacja komórek zarodkowych ES (Embrionic Stem Cells)
- transplantacja jąder komórkowych
2.Metody wektorowe:
- transfer DNA - przy pomocy wirusów
Mikroinjekcja
Przeżywa ja 50% zarodków, rodzi się ok. 30% przetransferowanych zarodków z czego 15% posiada zintegrowany transgen.
Wprowadzenie do przedjądrza egzogennego DNA, diploidalna zygota, powstaje zarodek. Podział w kulturze in vitro do kilkukomórkowej blastycysty i wszczepie się matce zastępczej.
Himera - oragnizm zbudowany z komórek które nie są identyczne pod względem genetycznym.
Modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES
Komórki uzyskane z węzła zarodkowego blastocysty. Można je hodować in vitro przez dłuższy czas i ponownie wprowadzić do blastocysty po uprzednim wprowadzeniu transgenu.
Knock-out genu:
Celem jest usunięcie określonego genu pozostawiając pozostałe geny nienaruszone, aby móc określić konsekwencje dla orgsanizmu pozbawionego tylko jednego badanego genu.
Komórki pierwotne są jeszcze niezróżnicowane, można je modyfikować. Izolacja pierwotnych komórek w kulturach in vitro. Mamy egzogenne DNA, wprowadza się za pomocą elektroforacji lub lipopekcji.
Wprowadzony do blastocysty, homologiczna rekombinacja między genem w jądrze pierwotnej komórki zarodkowej a komórką do której wprowadzamy. Na pożywce rozwijają się tylko te komórki w których zaszła rekombinacja.
Transplantacja jąder komórkowych
Polega na usunięciu jądra komórkowego z niezapłodnionego oocytu (komórki jajowej) i wszczepieniu jądra z innej komórki pochodzącej z organizmu jaki chcemy klonować. Jądro można pobierać z komórek zarodka, komórek hodowanych in vitro, a także z dorosłych osobników. Tą metodą powstała w '96 roku owieczka Dolly.
Dolly miała 3 matki:
1.Dawca komórki jajowej - oocytu pozbawionego komórki jajowej
2.Dawca materiału genetycznego z wymienia do oocytu
3.Urodziła Dolly, ale materiał genetyczny ja 2nd matka
Transfer DNA przy pomocy wirusów
Po wprowadzeniu obcego genu do genomu retrowirusa infekuje się nim komórki embrionalne we wczesnym etapie rozwoju. Uzyskane embriony z transgenem wprowadza się do matki zastępczej i otrzymujemy najczęściej potomstwo mozaikowate. Tą metodą można wprowadzić niewielkie fragmenty DNA:
- infekcje jednokomórkowych zarodków
- infekcje pierwotnych komórek zarodkowych ES.
Minusem jest wyciszenie
Celowość modyfikacji zwierząt:
1.Wykorzystanie zwierząt jako bioreaktorów
Modyfikowane: krowy, owce, kozy, wytwarzane białka wydzielane z mlekiem np. produkcja antytrombiny (czynnik krzepliwości krwi), antytrypsyny (leczenie rozedmy płuc), erytropoetyny (leczenie anemii), laktoferytryny (niedobór żelaza).
2.Szybszy wzrost zwierząt
Wprowadzenie genów kodujących hormon wzrostu (łosoś norweski)
3.Większa wydajność mleczna
Dodatkowe kopie genów kodujących beta i kappa-kazeinę
4.Odporność na choroby
Wytwarzanie przez zwierzęta swoistych immunoglobin, co zwiększa odporność na choroby np. krowy odporne na staphylococcus aureus powodujący zapalenie wymienia.
5.Modyfikowane świnie jako dawcy narządów
Knur-TG 1154 ma wbudowany gen który może znieść immunologiczną barierę międzygatunkową pomiędzy świnią i człowiekiem.
6.Do celów naukowych
Badanie funkcji genów, terapia genowa, układy modelowe chorób ludzkich np. zablokowanie funkcjonowania badanego genu u myszy, a następnie obserwacja cech fenotypowych osobnika w celu poznania funkcji badanego genu.
Żywność modyfikowana genetycznie
Transgeniczne rośliny są źródłem żywności, która jest określana terminem „nowa żywność”.
Pojęcie to obejmuje następujące typy GM:
- żywność będąca GMO (np, pomidory, ziemniaki)
- żywności zawierające przetworzone GMO (koncentraty, czekolada z lecytyną z soi GMO)
- żywność produkowana z zastosowaniem GMO, lecz nie zawierające komponentów transgenicznych (np. tłuszcze zestryfikowane z immobilizowanymi enzymami)
Cele modyfikacji genetycznej surowców dla przemysłu spożywczego:
1.Wzbogacenie żywności w składniki pachnące, ich wartość żywieniową (m.in. ziemniaki, rzepak, pomidory o większej zawartości suchej masy
2.Usuwanie substancji szkodliwych i niepożądanych (kawa- obniżenie zawartości kofeiny, eliminacja białek alergicznych)
3.Ułatwienie procesów przetwórczych i kształtowanie właściwości sensorycznych (seler, marchew - zachowanie kruchości, burak cukrowy - dłuższy okres przechowywania bez strat w zawartości cukru, pszenica - większa zawartość glutenu)
4.Kształtowanie cech funkcjonalnych żywności pod kątem korzystnego wpływu na zdrowie człowieka (rzepak o obniżonej zawartości tłuszczów nienasyconych, soja z obniżoną zawartością kwasu palmitynowego)
Czy żywność zawierająca genetycznie modyfikowane organizmy jest bezpieczna?
Tak, żywność ma być bezpieczna dla konsumentów, nie może szkodzić. Żywność ta jest częściej kontrolowana niż żywność konwencjonalna.
Czy spożywanie żywności genetycznie modyfikowanej wywołuje alergie?
Nie, zawsze przy wprowadzaniu produktów sprawdza się sekwencję aminokwasową czy są utajonymi lub nowymi alergenami. Żadna żywność GMO nie wywołuje alergii.
Czy na rynku europejskim występuje żywność GMO?
Tak, bardzo szeroki wachlarz - jogurty, serki, wędliny
Czy w Polsce można kupić GMO?
Tak - ekstrakt sojowy z soi genetycznie modyfikowanej, kotlety sojowe
Dlaczego powinno się znakować żywność GM?\
O są przeciwnicy GM żywności - dla nich takie oznaczenie, wegetarianie
Podstawowe zasady bezpiecznej pracy z GMO, wymagają wtedy:
- pełnej charakterystyki danego organizmu
- sposobów użytkowania i pracy z danymi organizmami
- warunków w których będą przebiegały wszelkie planowane operacje, łącznie z planem awaryjnym, w przypadkach zagrożenia
Regulacje prawne UE
Podstawowymi aktami prawnymi są dyrektywy
1.nr 19 z dnia 23.05.1990 w sprawie zamkniętego użycia GMO
Dyrektywa ta reguluje zamknięte użycie genetycznie modyfikowanych mikroorganizmów. nakłada na państwa obowiązek podjęcia wszelkich właściwych środków w celu uniknięcia zagrożeń, które mogłyby wywołać negatywny wpływ na ludzi i na środowisko.
Sformułowane są w niej zasady dobrej praktyki mikrobiologicznej oraz podstawowe zasady bezpieczeństwa i higieny pracy (BHP)
2.z 14.03.2001
Reguluje zamierzone uwolnienie GMO do środowiska w celach innych niż wprowadzenie do obrotu (cele eksperymentalne) oraz wprowadzenie do obrotu produktów GMO. Wprowadza obowiązek uwzględniania skumulowanych oddziaływań danego GMO na środowisko i zdrowie ludzi.
Rozporządzenie 2003
a)w sprawie genetycznie zmodyfikowanej żywności
b)w sprawie identyfikacji i oznaczania organizmów GM i identyfikacji produktów żywnościowych wytworzonych z org. GM
Wymagają one nowe procedury kontroli i udzielania zezwolenia wprowadzenia do obrotu GMO jako artykułów spożywczych i pasz oraz artykułów wyprodukowanych z GMO
3.Rozporządzenie 2003 w sprawie transgenicznego przeznaczenia org. GM
Celem jest utworzenie wspólnego systemu zaświadczenia i informowania o transgenicznym przeznaczeniu GMO oraz zapewnienie spójnego ustalenia postanowień Protokołu kartageńskiego w imieniu wspólnoty.
Protokół kartageński o bezpieczeństwie biologicznym do konwekcji o różnorodności biologicznej.
Dokument jest zbiorem przepisów mających na celu zapewnie odpowiedniego poziomu ochrony w dziedzinie bezpiecznego przemieszczania, prowadzenia prac i stosowania żywych zmodyfikowanych organizmów (ang. Living Modified Organism LMO) i stanowiący produkt nowoczesnej biotechnologii, które mogą mieć szkodliwy wpływ na ochronę i zrównoważone użytkowanie różnorodności biologicznej z uwzględnieniem zagrożenia dla zdrowia człowieka.
Regulacje prawne obowiązujące w Polsce:
- o org. genetycznie zmodyfikowanych (ust. z dnia 22.06.2001)
- o warunkach zdrowotnych żywności i żywienia (11.05.2001)
- o środkach żywienia zwierząt (23.08.2001)
- o nasiennictwie, nie można sprowadzać materiału genetycznego (04.2005)
Procedura wydania zezwoleń na wprowadzenie do obrotu produktów GMO,
Produkt genetycznie modyfikowany nie może:
- powodować negatywnych skutków dla zdrowia ludzi i zwierząt lub środowiska
- wprowadzić w błąd konsumenta
- różnić się od produktów, który ma zastąpić, w takim stopniu, że jego normalne spożycie może spowodować niekorzystne skutki dla zdrowia konsumenta.
Minister powiadamia Komisję Europejską i właściwe organy innych niż Rzeczpospolita Polska państw członkowskich UE o wydaniu zezwolenia na wprowadzenie do obrotu produktów GMO w terminie 30 dni od jego wydania. Zezwolenie to na okres nie dłuższy niż 10 lat.
Zezwoleniami Głównego Inspektora Sanitarnego w Polsce do obrotu dopuszczone są:
- preparaty białek sojowych oraz preparaty z kukurydzy (otrzymane z roś GM) - stosowane w przemyśle piekarniczym i produkcji przetworów mięsnych
- preparaty enzymatyczne otrzymane z drobnoustrojów zmodyfikowanych genetycznie w przemyśle mleczarskim, owocowym, warzywnym, piekarskim.