PCR

Polymerase Chain Reaction – Łańcuchowa reakcja polimeryzacji

Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:

• wyizolowana, o odpowiedniej czystości matryca DNA 

• odpowiednie środowisko reakcji- bufor, jony Mg²+

• startery

• dNTP

• termostabilna polimeraza DNA

• opcjonalnie: substancje stabilizujące

Jak należy dobrać startery do reakcji PCR:

• powinny zawierać około 50% par GC

• długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad

• startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz do drugiego startera

• temperatura ich topnienia powinna występować w przedziale 50-60˚C.

• nie mogą tworzyć struktur typu spinki do włosów

• muszą być komplementarne do fragmentów matrycy

• stężenie starterów w mieszaninie powinno być optymalne

• startery powinny być wydłużane w kierunku jeden do drugiego

  • Temperatura topnienia jest to temperatura dysocjacji dupleksu
    primer - matryca. 

  • Wartość temperatury topnienia rośnie wraz ze wzrostem zawartości cytozyny i guaniny w łańcuchu. Jest to spowodowane tym,
    iż pomiędzy tymi zasadami występuje po trzy wiązania wodorowe, natomiast pomiędzy adenina i tymina tylko dwa.

  •  Najprostszym modelem do obliczania temperatury topnienia jest formuła:

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach.

Trzy etapy PCR :

1) Denaturacja
2) Hybrydyzacja odcinków starterowych
3) Elongacja

Polimeraza Taq

• enzym z grupy polimeraz DNA wyizolowany z bakterii Thermus aquaticus

• stabilny termicznie

• nie wykazuje aktywności 3'->5' egzonukleazy

• Do swej aktywności wymaga jonów Mg

Tremocykler 

• Jest urządzeniem służącym do sterowania temperaturą.

• Zakres zmiany temperatury zależy m.in. od długości odcinka DNA, który planujemy powielić, od długości starterów oraz optimów temperaturowych enzymów (polimeraz).

• Sterowanie temperaturą możliwe jest dzięki wprowadzeniu do pamięci termocyklera określonego programu,na podstawie której powielamy badany DNA.

• Okresowe zmiany temperatury wywołują różnego typu reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie

Zalety metody PCR:

• Bardzo czuła.

• Prosta w wykonaniu

• Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu

• możemy powielać materiał genetyczny pobrany zarówno z żywych, jak i martwych tkanek

metoda specyficzna

Wady metody PCR:

• należy utrzymywać sterylne warunki : sterylność wszystkich używanych urządzeń w reakcji

• po reakcji PCR nie ma dowodów, że ta reakcja nastąpiła,
  aby to stwierdzić stosujemy elektroforezę.

Zastosowanie PCR:

• wykrywanie bardzo małych ilości bakterii w tkankach

• diagnostyka chorób dziedzicznych

• ustalanie ojcostwa

• przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi

• uzyskiwanie dużych ilości DNA np. do klonowania

• znakowanie fragmentów DNA

• cykliczne sekwencjonowanie

• identyfikacja organizmów – genotypowanie

Multipleks PCR

Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w czasie jednej reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia kilku par starterów
o podobnej temperaturze topnienia tak by można było użyć jeden profil temperaturowy reakcji.

ZALETY MULTIPLEKS PCR :

system wewnętrznej kontroli, kontrola jakości matrycy , wysoka wydajność

ZASTOSOWANIE MULTIPEKS PCR :

• wykrywanie delecji i innych zmian w sekwencji docelowej

• polymorphic Repetitive DNA (polimorficzne powtarzalne sekwencje DNA) 

• wykrywanie i charakteryzacja mikroorganizmów grzybów, bakterii , wirusów oraz pasożytów. 

Modyfikacje reakcji PCR: PCR-RFLP, RAPD-PCR , PCR-CCM, RT-PCR, ARMS-PCR, PCR-HD, Real-Time PCR 

ODWROTNA TRANSKRYPCJA

W reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystuje się właściwości niektórych polimeraz DNA zależnych od RNA do syntezy nici cDNA na RNA jako matrycy.

Odwrotna transkrypcja odbywa się w kierunku 3'→5'.

RT-PCR

 Jedna z modyfikacji metody PCR, w którym pierwszy etap jest przeprowadzony przez odwrotną transkryptazę, a jako matryca służy cząsteczka mRNA.

Zastosowania RT-PCR

• Wykrywanie nawet minimalnej obecności RNA w próbie.

• Diagnozowanie chorób genetycznych.

• Wprowadzanie informacji genetycznej komórki eukariotycznej do komórki prokariotycznej. (Inżynieria genetyczna)

• Wykrywanie nowotworów. (wykrywanie cząsteczek mRNA –biomarkerów typowych dla danego typu komórki nowotworowej.)

Dwa warianty RT-PCR

• Wariant I :

1) Reakcja mniej czasochłonna.

2) Małe ryzyko zanieczyszczenia środowiska rekacji wszechobecnymi enzymami bądź kwasami nukleinowymi.

• Wariant II :

1) Możliwość zastosowania optymalizacji reakcji np. Poprzez dobór warunków reakcji.

2) Szerokie pole możliwych zastosowań zależne od użytego specyficznego primera ( startera).

3) Możliwość otrzymywania bardzo długich komplementarnych łańcuchów DNA (cDNA)

Odwrotne transkryptazy

• Odwrotna transkryptaza (rewertaza) jest to polimeraza DNA zależna od RNA.

• Posiada 3 rodzaje aktywności:

1. Aktywność polimerazy DNA zależnej od RNA.

2. Aktywność rybonukleazową .

3. Aktywność polimerazy DNA zależnej od DNA.

• Za jej odkrycie w 1975 roku przyznano nagrodę Nobla.

• Rewertaza występuje u retrowirusów (np. HIV) i niektórych wirusów DNA (Hepadnawirusy).

• Odwrotna transkryptaza kodowana jest przez retrotranspozony (specyficzna cząsteczka RNA) występujące w genomie organizmów eukariotycznych.

Odwrotne transkryptazy służące w RT- PCR:

• RT HIV-1Inhibitorem RT HIV-1 jest azydotymina, zapobiega ona replikacji i wstrzymuje syntezę łańcucha DNA. Jest jednym ze składników koktajlu inhibitorów używanych w terapii wielolekowej AIDS.

• Telomeraza- enzym o aktywności polimerazy DNA zależnej od RNA. Jego zadaniem jest dobudowanie 3’ końcowego odcinka DNA na nici opóźnionej (synteza telomerów). W ten sposób zabezpiecza strukturę DNA przed skracaniem się. Telomeraza jest wyjątkowo aktywna podczas rozwoju embrionalnego. Jej ekspresja w komórkach somatycznych obniża się jednak w parę tygodni po narodzinach. Z jej mutacjami związane są takie choroby, jak: wrodzona dyskeratoza, anemia plastyczna, idiopatyczne włóknienie płuc. Schorzenia te są wynikiem występowania zbyt krótkich i dysfunkcyjnych telomerów. 

• RT M-MLV -monomeryczny enzym wyizolowany z mysiego wirusa leukemii (białaczka spowodowana np. działaniem retrowirusów). Jest rekombinowaną polimerazą DNA , która syntezuje nowy łańcuch DNA z pojedynczej nici RNA, DNA, bądź hybrydy DNA- RNA (dwuniciowa cząsteczka kwasu nukleinowego DNA + RNA połączone na zasadzie komplementarności).

Real-time PCR

• Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR); czuła metoda analityczna stosowana w genetyce.

• Główne cechy real time PCR:

1. umożliwia jednoczesne namnażanie DNA oraz monitorowanie ilości produktów powstających podczas kolejnych cykli (amplikonów),

2. czułość

3. metoda jest znacznie mniej czaso- i pracochłonna,

4. szeroki zakres oznaczanych stężeń oraz wysoka powtarzalność uzyskiwanych wyników

5. wysoki koszt analizy i drogi sprzęt

W skład mieszaniny reakcyjnej standardowej reakcji PCR wchodzą: oligonukleotydowe primery nukleotydy będące substratami, bufor zapewniający odpowiednie środowisko reakcji, jony magnezu, termostabilna polimeraza DNA: polimeraza Taq (Thermus aquaticus), Pfu DNA polimeraza (Pyrococcus furiosus).

• Dzięki zjawisku fluorescencji real- time PCR pozwala śledzić proces namnażania się DNA w czasie rzeczywistym i tym samym oznaczyć ilości produktu w fazie jego wykładniczego wzrostu.

• Cykl, w którym sygnał fluorescencji osiągnął wartość graniczną pozwalającą ma jego wykrycie (ang. threshold cycle C_t). Od cyklu progowego rozpoczyna się wczesna faza logarytmiczna PCR.

Znaczniki do fluorescencji:

• specyficzne (zależne od sekwencji nukleotydów), np. wygaszacze i reportery w sondach TaqMan (wyg.: TAMARA rep.: 6- karboksyfluoresceina) i typu „spinka do włosów”.

niespecyficzne (niezależne od sekwencji nukleotydów; wykorzystują barwniki wiążące się z DNA) np. SYBR Green I- najczęściej stosowany niespecyficzny barwnik, najprostszy i najbardziej ekonomiczny sposób na detekcję i ilościowe oznaczenie produktów reakcji rt-PCR, metoda wykorzystywana jest do analizy liczby kopii cząsteczek cDNA przepisanego z RNA, gdzie dsDNA będzie produktem reakcji PCR. , bromek etydyny

Sonda TaqMan

Jest to krótki odcinek DNA wyznakowany cząsteczką fluorescencyjną na końcu 5’ oraz związkiem wygaszającym na końcu 3’. Gdy znajdują się one w bliskim sąsiedztwie, tzn. obie są przyłączone do tego samego oligonukleotydu, wygaszacz pochłania sygnał emitowany przez reporter. Podczas amplifikacji oligonukleotyd ulega rozdzieleniu dzięki aktywności 5’ egzonukleazowej polimerazy DNA Taq. Reporter i wygaszacz zostają rozdzielone i w ten sposób zostaje uwolniony sygnał fluorescencji.

Zalety:

• wysoka specyficzność,

• wykrywają ewentualne mutacje punktowe zachodzące podczas powielania prób.

Wady:

• wysoki koszt metody.

Dzięki obecności w tych sondach komplementarnych sekwencji wewnętrznych, ich drugorzędowa struktura przybiera charakterystyczną postać spinki do włosów, która jest niszczona podczas amplifikacji. Powoduje to rozdzielenie reportera i wygaszacza, a zatem wyzwolenie sygnału fluorescencji, który wcześniej był rozpraszany w postaci ciepła.

• Real-time PCR umożliwia precyzyjne rozróżnienie i oznaczenie sekwencji kwasów nukleinowych nawet w bardzo małej próbce.

• Może być wykorzystywana do wykonywania analiz na obecność obcych fragmentów DNA.

• Znajduje szerokie zastosowanie, m.in. do: wykrywania znanych mutacji, wykrywania patogenów (wirusy, bakterie, grzyby), badania poziomu ekspresji genów.