Jakub Sobieraj 25.10.2011r.

Ćwiczenie 2.

Budowa, właściwości i funkcja białek

Aminokwasy łączą się ze sobą wiązaniem peptydowym i to prowadzi do powstania liniowej makrocząsteczki- polipeptydu. Łańcuch polipeptydowy zawierający ponad 100 reszt aminokwasowych tworzy białko. Białka są to wielkocząsteczkowe biopolimery, a właściwie biologiczne polikondensaty, zbudowane z reszt aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi -CONH-. Występują we wszystkich żywych organizmach oraz wirusach. Synteza białek odbywa się przy udziale specjalnych organelli komórkowych zwanych rybosomami.

Białka ze względu na skład można podzielić na proste(zbudowane tylko z aminokwasów) i złożone(zawierają różne komponenty nie aminokwasowe), które dzieli się na grupy: glikoproteiny, lipoproteiny, metaloproteiny, fosfoproteiny, nukleoproteiny, chromoproteiny.

Ze względu na pełnione funkcje białka możemy podzielić na: enzymatyczne, strukturalne (odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek np.: kolagen, elastyna, tubulina, aktyna), transportujące (hemoglobina transportuje tlen, transferryna przenosi żelazo), regulacyjne (hormony, receptory oraz czynniki transkrypcyjne), odpornościowe (immunoglobuliny- chronią organizm przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami), motoryczne (uczestniczą w procesach związanych z ruchem- aktyna, miozyna), zapasowe (ferrytyna- wiąże żelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym mleka).

Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzieli się na fibrylarne (włókienkowate: kolagen, elastyny, fibroina jedwabiu), i globularne (kuliste: białka obojętne, kwaśne i zasadowe)

Cząsteczki białek są amfoterami tworzącymi w roztworach wodnych koloidy, fazę rozproszoną stanowią cząsteczki białka o wymiarach 5-100 nm. Białka, które wykazują powinowactwo do wody tworzą koloidy hydrofilowe. Białka w pH równym punktowi izoelektrycznemu są elektrycznie obojętne. Białko wytraca się najłatwiej w punkcie izoelektrycznym. Rozpuszczalność białek maleje w pH zbliżonym do wartości pI. Białka w wodzie destylowanej rozpuszczają się bardzo słabo, ich rozpuszczalność rośnie wraz ze wzrostem siły jonowej. Dzieje się tak, ponieważ rośnie liczba jonów nieorganicznych na powierzchni białka zapobiegając ich agregacji. Przy dużej sile jonowej, sól odciąga cząsteczki wody od powierzchni białek i doprowadza do ich agregacji (wysalanie białka).

Rozpuszczalność białek zwiększa się w ograniczonym zakresie wraz ze wzrostem temperatury. W temperaturze powyżej 40-50⁰ C większość białek zaczyna tracić trwałość i ulega denaturacji. Denaturacja pociąga trwałą utratę funkcji biologicznych i wiąże się ze zmianami w strukturze drugo-, trzecio- i czwartorzędowej białka.

Doświadczenie 1:

Wytracanie białek w punkcie izoelektrycznym:

Do 1 ml 0,1% roztworu kazeiny dodawaliśmy około 1,5 ml 0,5 M roztworu kwasu octowego, cały czas wytrząsając. Zaobserwowaliśmy zmętnienie roztworu spowodowane wytraceniem się białka, które rosło z upływem czasu. Po 5 min znowu dodawaliśmy ok 1,5 ml 0,5 M roztworu kwasu octowego i zauważyliśmy rozpuszczanie się kazeiny po obniżeniu pH.

Doświadczenie 2:

Frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu:

Do 2 ml surowicy dodaliśmy 2 ml nasyconego roztworu (NH₄)₂SO₄. Po zmieszaniu agregujące globuliny odwirowaliśmy w wirówce stołowej , następnie klarowny supernatant zlaliśmy do suchej probówki wirówkowej. Do osadu globulin dodaliśmy niewielką ilość wody destylowanej w celu całkowitego rozpuszczenia białek. Do supernatantu dodawaliśmy, cały czas wytrząsając, kryształki (NH₄)₂SO₄ do momentu aż otrzymaliśmy roztwór nasycony, w którym kryształki siarczanu amonu przestały się rozpuszczać). Wzrost siły jonowej powoduje wytrącenie się frakcji albumin.

Doświadczenie 3:

Wytrącanie białek surowicy krwi etanolem:

Do 0,5 ml surowicy 10x rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl dodaliśmy 1 ml 96% etanolu. Powstało zmętnienie, które zniknęło po natychmiastowym rozcieńczeniu 0,9% NaCl lub wodą.

Doświadczenie 4:

Strącanie białek za pomocą kationów:

Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodaliśmy parę kropel roztworu: AgNO₃, HgCl₂ oraz (CH₃COO)₂Pb. We wszystkich probówkach wytraciły się białe osady.

Doświadczenie 5:

Kalorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową:

Nr. Próby, C [mg/0,5ml]	r. wzorcowy [ml]	H2O [ml]	odczynnik biuretowy [ml]	A1	A2	A śr. (A1+A2/2)	K
1	0,1	0,4	2	0,095	0,100	0,0975	10,26
2	0,2	0,3	2	0,202	0,203	0,2025	9,880
3	0,3	0,2	2	0,301	0,296	0,2985	9,880
4	0,4	0,1	2	0,397	0,394	0,3955	10,11
5	0,5	0	2	0,483	0,480	0,4815	10,38
6 "0"	0	0,5	2	-	-	-	-
7(surowica 0,5ml)	0,5	0	2	0,394	0,394	0,394	1,43
8(surowica 0,1ml)	0,1	0,4	2	0,073	0,072	0,0725	1,38

Tabelka nr1.

Albumina: Surowica:

Aśr.=0,2951 Kśr.=10,136 Aśr.=0,2108 Kśr.=1,41

C=Aśr.*Kśr. C=Aśr.*Kśr.

C=0,2951*10,136=2,99 [mg/0,5ml] C=0,2108*1,41=0,297 [mg/0,5ml]

C=2,99*2=5,98 [mg/ml] C=0,297*2=0,594 [mg/ml]

5,98*10^-3=0,00598 [g/ml] C=0,594*10^-3=0,000594 [g/ml]

0,000594*10=0,00594 [g/ml]

Wnioski:

Białka najłatwiej wytrącają się w punkcie izoelektrycznym. Jeżeli proces ten zachodzi w niskiej temperaturze, to uzyskane białko ma zachowane cechy białka natywnego.

Przy odpowiednio dużej sile jonowej sól(siarczan amonu) odciąga cząsteczki wody od powierzchni białek, co umożliwia ich agregację. Globuliny posiadają zdolność do agregacji dlatego w reakcji z siarczanem amonu wypadły jako pierwsze.

Białka surowicy krwi ulegają wytrąceniu pod wpływem etanolu, ale wracają do swojego stanu po zobojętnieniu zasadą lub po dodaniu wody.

Białka w pH wyższym od pI posiadają ładunek ujemny i mogą reagować z kationami. Kationy metali ciężkich (Hg²⁺, Ag⁺, Pb²⁺) tworzą z białkami sole nierozpuszczalne.