Markerowa mapa genomu: - w którym miejscu występuje loci i w jakich odległościach od siebie.

*Mapa sprzężeniowa (genetyczna):

-określenie kolejności loci sprzężonych w chromosomie i odległości względnych między nimi

*Mapa fizyczna (cytogenetyczna):

-wskazanie miejsca w chromosomie (identyfikowanego w stadium metafazy mitotycznej), w którym jest locus danego markera.

Fizyczna markerowa mapa genomu – tworzona jest między innymi w oparciu o technikę fluoroscencyjnej hybrydyzacji in situ.

Lokalizacja sondy zawierającej marker mikro satelitarny w chromosomie 9 jenota chińskiego.

Mapowanie fizyczne genomu może być wykonywane również przy pomocy techniki hybrydyzacji komórek somatycznych.

Hybrydyzacja komórek somatycznych:

*Fuzja komórek somatycznych:

-komórki „nieśmiertelne” linii nowotworowej

-komórki somatyczne gatunku mapowanego

*selekcja komórek hybrydowych

*wyprowadzenie klonów > utrata chromosomów gatunku mapowanego

*analiza biochemiczna klonów (polimorfizm białek, polimorfizm sekwencji mikro satelitarnych).

Analiza klonów:

*Analiza molekularna (elektroforeza):

-identyfikacja markerów klasy I

-identyfikacja markerów klasy II – sekwencje mikrosatelitarnej wykrywane za pomocą specyficznych dla danego gatunku starterów (PCR)

*Analiza cytogenetyczna:

-barwienie prążków – identyfikacja chromosomów pochodzących z genomu gatunku mapowanego

-FISH lokalizacja sond markerowych.

Hybrydyzacja komórek somatycznych:

Komórka nowotworowa (2n = 40) + fibroblast bydlęcy (2n= 60) daje nam to wyjściową 100

Identyfikacja loci występuje w tym samym chromosomie = loci synteniczne .

Loci synteniczne:

-kodujące (geny) i niekodujące (np. mikro satelity)

-występują w tym samym chromosomie

-identyfikowane przy pomocy analizy biochemicznej hybrydowych klonów

-Loci synteniczne mogą być zlokalizowane w konkretnym chromosomie, jeśli analiza cytogenetyczna klonu wskaże, że chromosom gatunku mapowanego jest w nim reprezentowany.

Poszukiwanie loci synteniczny albo są w tym samym miejscu albo ich nie ma.

Lokalizacja chromosomowa grupy syntenicznej jest możliwa poprzez lokalizację cytogenetyczną jednego z markerów syntonicznych – np. Mar 1 i Mar 2.

Mapowanie radiacyjne:

-komórki gatunku mapowanego poddawane są naświetlaniu promienia jonizującego

-fragmentacja chromosomów

-hybrydyzacja z komórkami nośnikowymi

-wyprowadzenie klonów, w których zachowane są tylko fragmenty chromosomów gatunku mapowanego

-analiza klonów> wskazanie genów syntonicznych.

Mapowanie radiacyjne:

-wielkość fragmentów chromosomowych zależy od dawki promieniowania:

*-5.000 radów – przeciętna wielkości fragmentu chromosomu wynosi ok. 16 mln pz (Mpz)

*-12.000 radów

-1 cRay5000 (1cR) – jednostka odległości między loci definiowanego jako 1-procentowa częstość pęknięcia nici chromatynowej między dwoma loci, jeśli komórka została naświetlona dawka 5000 radów w pojedynczym klonie zawarte jest przeciętnie ok. 20% genomu gatunku .

Lokalizacja chromosomowa grupy syntenicznej, w mapowaniu radiacyjnym, jest możliwa poprzez lokalizację cytogenetyczną.

Mapowanie fizyczne genomu psa.

Porównanie klasycznej techniki hybrydyzacji komórek somatycznych (HKS) z mapowaniem radiacyjnym (MR):

*HKS:

-identyfikacja loci syntenicznych, które są przyporządkowane całemu chromosomowi, bez możliwości ustalenia jaka jest odległość między nimi

-lokalizacja fizycznych (FISH) jednego locus nie pozwala na wnioskowanie o położeniu fizycznym pozostałych loci syntonicznych

*MR:

-identyfikacja blisko położonych względem siebie loci syntenicznych oraz ustalenie odległości miedzy nimi (cR)

-lokalizacja fizycznych (FISH) jednego locus pozwala na wnioskowanie

Stan markerowych map genomowych:
*bydło: - Zintegrowana mapa radiacyjna zawiera 5593 loci

*świnia:- mapa radiacyjna 4016 loci

*pies: - mapa radiacyjna 4249 loci

Wykorzystanie cytogenetycznych map genomowych:

-identyfikacja regionów chromosomowych zawierających poszukiwany locus (badania prowadzone z wykorzystywaniem map sprzężeniowych oraz mapowania porównawczego)

-diagnostyka mutacji chromosomów

-analiza rearażancji chromosomowych, które miały miejsce podczas ewolucji kariotypów

Sprzężeniowa mapa genomu:

-1 cM (centymorgan) – odległość pomiędzy dwoma loci, która zachodzi oznacza, że crossing over w tym obszarze zachodzi z częstością jeden raz na 100 mejoz

-długość genomu ssaków zawiera się w przedziale od ok. 2000 cM (mysz, świnia) do 3000 cM (człowiek, bydło)

-długość genomu mierzona na podstawie mejozy żeńskiej jest większa niż mierzona w oparciu o mejozę męską.

Budowa genetycznej mapy markerowej:

*Analiza segregacji alleli markerowych w rodzinach – identyfikacja markerów dziedziczących się zależnie (czyli sprzężone):

-krzyżowanie testowe > AaBb * aabb

-test lod-score > pozwala analizować dziedziczenie w różnych rodzinach (tzw. informatywnych, czyli takich gdzie możliwe jest ustalenie fazy sprzężeniowej między allelami w genotypach rodziców).

Mapowanie genetyczne – opiera Siena analizie siły sprzężenia między loci i prowadzone jest poprzez analizę segregacji alleli badanych markerów (loci) w rodzinach.

Budowa genetycznej mapy markerowej:

-analiza segregacji alleli markerowych w rodzinach – identyfikacja markerów dziedziczących się zelżenie ( czyli sprzężonych)

-ustalanie odległości genetycznej (cM) między sprzężonymi loci

-kojarzenie informatywne, to takie kojarzenia, w których potrafimy ustalić fazę sprzężenia między allelami z różnych loci.

LOD Score

Lod = Z = log10(L(r)/L(0,5))

L – prawdopodobieństwo wystąpienia określonych genotypów przy założeniu częstości rekombinacyjnej r, jeśli hipotezą alternatywną jest dziedziczenie niezależne 0,5

r- częstość rekombinacji

n – liczba potomków o fenotypie rodzicielskim

m – liczba potomków – rekombinantów

Odległość na mapie sprzężeniowej między loci obliczana jest przy pomocy funkcji Kosambiego, a jednostką odległości jest 1cM

X = 0,25ln((1+2r)/(1-2r))

r- współczynnik rekombinacji, zawiera się w przedziale (0;0,5)

Odległość wynosząca 1 cM oznacza, że crossing over między dwoma analizowanymi loci zachodzi 1 raz na 100 mejoz.