Patomorfologia

Seminarium 1

Violetta Filas

1. Etapy badań patomorfologicznych

• Wybór pacjenta przez klinicystę

• Pobranie materiału w poradnie lub na oddziale

• Materiał tkankowy – pobrany podczas operacji

Musi być utrwalony w 10%roztworze formaliny buforowej – czas maksymalnie do 48godzin

Formalina – 100ml

Na2HPO4 – 6,5g

NaH2PO4 – 4g

Woda destylowana – 900ml

Objętość formaliny w stosunku do materiału w stosunku 1(materiał) : 10(formalina)

• Materiał cytologiczny – płyn pobrany na oddziale, wymaz w trakcie bronchoskopii, materiał aspiracyjny pobrany z tarczycy, gruczołu piersiowego, biopsji, przy udziale tomografii komputerowej

1. Utrwalanie materiału

• Utrwalacz:

10% roztwór formaliny buforowanej

96% alkohol etylowy – natychmiast po poraniu wymazu cytologicznego, potem stosuje się barwienie

• Czas utrwalania:

48godzin

24godziny – drobny materiał

1. Badanie śródoperacyjne – INTRA :

• Materiał świeży

• Jest zamrażany, rozdrabniany, barwiony, robiony jest rozmaz i ocena pobranej próbki

• Rak – zawsze złośliwy nowotwór pochodzenia nabłonkowego

• Zmiana oglądana jest makroskopowo,

• Wynik badania śródoperacyjnego jest bardzo szybko -> można podjąć decyzje co do zakończenia operacji

• Następnie badanie formalinowe – cześć materiału zostaje rozmrożona i zanurzona w formalinie, a nastepnie poddana standardowemu badaniu patomorfologicznemu

1. Procesor tkankowy – przeprowadzanie przez alkohole, odbarwia się materiał, potem parafina -> opracowany materiał przechowuje się nawet 30 lat, można z niego zrobić preparat, prowadzić dalszą daignostykę, bloczki przechowywane w temperaturze pokojowej

2. Mikrotom – bloczki krojone na małe

3. Barwienie H+E Hematoksylina Mayera i Eozyna 1% - podstawowe barwniki, poddaje się działaniu alkoholi,

4. Ocena preparatu

5. Wypisywanie wyników

6. Metody patomorfologiczne:

1. Cytologiczne

• Aspiracyjna: biopsja, biopsja aspiracyjna pod kontrolą usg, cytologia aspiracyjna, cienkoigłowa -> z materiału robi się  rozmaz część zalewa sie alkoholem, część wybarwia metodą M+E, aby materiał się nie wysuszył należy zanurzyć w utrwalaczu, kilka szkiełek w jednym pojemniku oddzielać spinaczami, opisywać ołówkiem – przed wykonaniem rozmazu

Utrwalanie materiału jest ściśle związane z metodą barwienia (przed utrwalaniem trzeba znać metodę barwienia)

H+E,

• Ginekologiczna ??

1. Histochemiczne

2. Immunohistochemiczne

3. Metoda FISH

1. Materiały z płynów :

• jamy surowicze - jamy opłucnej,

• płyny przesiękowe – niski ciężar włąściwy, mała zawartość białka, powstają w wyniku utraty równowagi między ciśnieniem hydrostatycznym i onkotycznym przycyzny: przewlekłą niewydolnośc PK serca, marskość wątroby, niewydolność nerek

• ważne jest aby w płynie do badania było dużo komórek

• często kilka razy badanie płynów

• płyn wysiękowy – wysoki ciężar właściwy, wysoka zawartość białka i komórek zapalnych, powstają w skutek uszkodzenia międzybłonka przez infekcje, promieniowanie jonizujące lub nowotwory

Przygotowanie materiału do badania:

• nakłucie igłą: jamy opłucnej, osierdzia, otrzewnej

• płyn natychmiast po pobraniu odwirować

• zlać płyn znad osadu

• utrwalić w alkoholu

1. Płyny nowotworowe:

• Złośliwy międzybłoniak

• Pierwotny chłoniak błon surowiczych

• Przerzuty nowotworowe

Diagnostyka płynów nowotworowych: opiera się wyącznie na ocenie morfologii komórek, badania dodatkowe: immunohistochemia, cytochemia

Przerzuty nowotworowe:

• Adenocarcinoma:

Najczęstsze przerzuty do jam surowiczych: rak gruczołu piersiowego, płuca, jajnika(marker raka jajnika oznaczany w surowicy –CA125), żołądka

• Ca microcellulare

• Ca planoepitheliale

• Melanoma malignum

• Chłoniak złośliwy –

Zastosowanie immunohistochemii w onkologii.

1. Zastosowanie metod immunohistochemicznych:

• Ustalenie histogenezy nowotworu – określenie z jakim nowotworem mamy do czynienia

• Ocena fenotypu komórek nowotworowych uzyskanych podczas BAC (biopsji cienkoigłowej) – reakcja z przeciwciałami,

• Odróżnienie nowotworów pierwotnych od przerzutowych

• Ocena przerzutów do węzłów

• Wskazania do terapii – oznaczenie poziomów hormonów, czy możliwa jest terapia hormonalna

• Badania węzłów wartowniczych – najbliższy węzłeł zmiany nowotworowej, znakuje się go substancją barwną, potem bada się go, czy w nim są przerzuty nowotworowe, jesli nie ma w nim przerzutów, jest duża szansa, że pozostałe węzły nie są również zajęte – barwienie H+E

1. Markery – są to substancje chemiczne, które można wykryć w surowicy krwi i na tej podstawie ocenić możliwość występowania nowotworów:

CK7+ CK20+: rak urotelialny, jajnika(śluzowy), trzustki, żołądka, dróg żółciowych

CK7- CK20- : płaskonabłonkowy, nerki, prostaty, wątroby, jelita

Oznaczenie około 10 różnych markerów zazwyczaj pozwala na postawienie diagnozy i zróżnicowanie, jaki nowotwór występuje u pacjenta

1. Beta HCG – oznacza się również u mężczyzn, jest to marker typowy dla nowotowru jądra

Rak piersi: Receptor HER2 – ocena punktowa 0 do +3, 0 i 1+ : odczyn negatywny, 2+;

3+ silny odczyn błonowy obejmujący pełny obwód blony komórkowej w ponad 10%komórek, progesteron, estrogen, - przed operacją oznaczenie hormonów, badanie histopatologiczne przed chemioterapią

1.Metoda FISH, Interpretacja wyników, do czego służy

2.Co to jest metoda CISH – do czego służy, interpretacja wyników

3.Podobieństwa i różnice – porównanie metod

4.Co to jest rodzin EGFR

5.Co to jest receptor i gen HER2?

6. Co to jest herceptyna

1. Receptor HER2 – biologiczny podpis raka

• Ludzki, naskórkowy receptor dla czynnika wzrostowego określany również jako ErbB2 = rodzina EGFR

• Receprot HER2beirze udział w przekazywaniu sygnału wzrostu komórki, tym samym o nadmiernym wzroście -> czyli o tworzeniu nowotoru

• Głównie oceniany przy raku piersi

• Ludzkie receptory tego typu często nazywane są HER 1,2 – onkoproteiny ,3 i 4 – prawdopodobnie mają funkcje onkogenne

• Rodzina receptorów HER – różnica polega na tym,że wychwytują inny ligand

• Na zewnątrz 4 domeny, a dwie z nich łapią ligand, wewnątrz 3 domeny

• ErbB-2 (HER2neu ) – dla niego nie znaleziono ligandów, jego aktywacja następuje poprzez tworzenie dimerów – połączenie z innym dimerem, heterodimeryzacja – pomiędzy różnymi receptorami homo-takimi samymi

• Nadespresja HER-2 koreluje z gorszym rokowanie i krótszym okresem przeżycia chorych, najbardziej oporny na degradację przez mechanizmy wewnatrzkomórkowe, trudniej ulega inaktywacji w srosunku do innych członków rodziny HER

• Her 2 zlokalizowany jest na chromosomie 17

• Receptory 1,3,4 – przyłaczają różne ligandy

• Połączenia HER 2 i HER3 – jest najsilniejszą parą receptorów, która odgrywa rolę w proliferacji i transformacji komórkowej

• W przypadku her-2 najsczęściej tworzone są heterodimery (ErbB-2/ErbB-3 – najsilniejsza para receptorów ErbB)

• Również prawidłowo występują te receptory

• Nadekspersja – wzrost receptorów, wzrost genu ErbB-2 wewnatrz komórki

Metody oznaczania stanu HER-2

• IHC – immunohistochemiczna – ocenia stopień nasilenia reakcji barwenej odczynu błonowego po zastosowaniu przeciwciał przeciwko różnym epitopom receptora zlokalizowanym na powierzchni komórki – eksprecja receptora (O,1+,2+3+)

1. Trastuzumab – herceptyna:

• Pierwsze przeciwciało monoklonalne skuteczne w leczeniu chorych z uogólnionym rakiem piersi i nadekspresja receptora HER2 albo amplikacją(powieleniem) genu ErbB-2

• Pierwsze leczenie celowane wybiórczo przeciwko komórkom nowotworowym w raku piersi

• Przerwanie przewodzenia sygnału poprzez blokowanie receptora HER2(hamowanie proliferacji,a nie pozbywanie się ich) – główny mechanizm działania,

• Jeśli pacjentka zostaje poddana takiemu leczeniu, do końca życia powinna otrzymywać herceptynę, przez pierwszy rok się podaje, potem według obliczeń określa się zmniejszoną dawkę na kilka lat,lecz do końca życia pacjentka musi być leczona

• Blokowanie receptora przeszkadza w dawaniu dalszych przerzutów

1. METODA FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Podjerzenie -> lekarz-> usg, mammografia -> biopsja cienko lub gruboigłowa -> resekcja częściowa lub całkowita

Estrogen, progesteron, I67, HER2

Score 2+ - niezdiagnozowane – oznaczenie inną metodą, jeśli mają amplifikację lub nadekspresje receptora HER2 – podanie herceptyny, jeśli nie – inne leczenie

• Metoda FISH – można wykryć translokację, amplifikacje lub delecje, w przypadku genu ErbB2- wykrywyamy amplifikacje

• Hybrydyzacja in situ – metoda biologii molekularnej, stosująca którkie odcinki dna tzw. Sondy molekularne znakowane barwnikami fluorescyncyjnymi

• Różnica między IHC – kilka godzin, koszt 65-75zl FISH – większa czułość reakcji, względnie wysoka swoistośc, jednak wadą jest duża pracochłonność,wieloetapowość reakcji – kilka dni(18-21h), wysokie koszty (ok 600zl )stosowanych odczynników

• FISH –

1 etap- trawienie enzymatyczne pepsyną albo proteinazą K - pozbycie się błon komórkowych i białek,celem dojścia do jądra kom. I DNA

2 etap- nałożenie sond molekularnych, następuje denaturacja, hybrydyzacja

3 etap – wyeliminowanie niepotrzebnych części sond molekularnych

4 etap – nałożenie znaczników DAPI

sonda składa się z 2 cześci: 1 – komplementarna to feny HER2 i znakowanej na czerwono, druga część sondy komplementarna do centromeru chromosomu 17 i znakowana na zielono

• interpretacja wyników: zlicza się z 40-60jąder komórkowych RATIO

R= ilość sygnałów pochodzących od HER2/ ilość sygnałów pochodzących od CEP17

Jeśli jest >2 – amplifikacja

Jeśli jest < 2 – brak amplifikacji

• kiedy wykonujemy FISHa: kiedy IHC wynik jest 2+,

kiedy na pewno mamy do czynienia z nowotworem złośliwym

w rozpoznaniu carcinoma in situ – rak przedinwazyjny, niezłośliwy, her 2 na 2+ - nie wykonujemy weryfikacji metodą FISH

• po co wykonujemy FISHa: nie tylko żeby zobaczyć czy jest amplifikacja,czy nie, po to, żeby zdiagnozować, czy pacjentka jest to leczenia herceptyną ,czy nie

• receptor 2 i 3 – główne działanie proliferacji

• różnica między FISHem i CISHem