Wykład 3, 17.10.2013

Biologia syntetyczna

Biologia syntetyczna- jest to nowa metoda integrująca nauki biologiczne, inżynieryjne i matematyczne. Dzięki temu istnieje możliwość lepszego rozumowania mechanizmów sterujących biologicznymi procesami. Opiera się na konstruowaniu lub przechowywaniu składników, w kombinacje i systemy, które nie występują naturalnie. Wykorzystuje elementy inżynierii, nanotechnologii i biologii molekularnej. Termin wprowadzony przez Wacława Szybalskiego (1974 r.)

Zastosowanie biologii syntetycznej:

• Pozwala na lepsze poznanie molekularnych mechanizmów kierujących procesami regulacyjnymi w komórkach. Ma to znaczenie w medycynie i wielu procesach biochemicznych w przemyśle, przez konstrukcje mikroorganizmów, które mogłyby wytwarzać nowe farmaceutyki, degradować substancje toksyczne, niszczyć kom rakowe, produkować wodór dla „samochodów” przyszłości, czy naprawiać uszkodzone geny.

• Podstawa do tworzenia komputerowego systemu, który pozwoli na ominiecie prób klinicznych podczas wprowadzania nowych leków

• Zsyntetyzowanie pętli pamięci DNA, co było znaczącym krokiem w stronę rozwoju biologii syntetycznej.

biosensory biopaliwa

terapie enzymy kosmetyki związki chemiczne

BIOLOGIA SYNTETYCZNA

chemia biologia molekularna inżynieria fizyka

Wykorzystanie biologii syntetycznej w procesie doskonalenia szczepów:

1. opracowanie zmian w sieciach

2. identyfikacja aktywnych, molekularnych zależności

Strategia selekcji szczepów E. coli z nadprodukcja likopenu

- delecja trzech genów np. dehydrogenazy glutationu oraz fosfoglukomutazy powoduje nadprodukcję likopenu (następuje knockout genowy)

Podsumowanie:

• Doskonalenie drobnoustrojów przemysłowych jest podstawą do komercjalizacji określonych produktów tj. enzymy, aminokwasy, antybiotyki i inne.

• Istotny wpływ na efektywność stosowanych metod ma znajomość szlaków metabolicznych dla doskonalenia produktów.

• Dobór drobnoustrojów do określonego procesu powinien uwzględniać skład podłoża oraz warunki hodowli.

• Dla uzyskanie lepszej wydajności bioproduktów przy wykorzystaniu inżynierii metabolicznej niezbędna jest skoordynowana ekspresja (lub /i) inhibicja kilku genów.

• Wykorzystanie w okresie racjonalnego projektowania nowych systemów i technik modelowania matematycznego w celu przewidzenia zachowania się układu i optymalizacji jego działania

Wstępne różnicowanie aktywności:

• Dobór aktywnych szczepów do celów technologicznych można prowadzić stosując testy skriningowe już podczas izolacji kolonii lub testując wyizolowane wcześniej kultury.

• Z powodu braku kryteriów wstępnej oceny aktywności metabolicznej testowanie wyizolowanych wcześniej kultur wymaga zastosowanie bardzo pracochłonnych i mało wydajnych sposobów oceny losowo wybranych kolonii w testach fermentacyjnych.

• Możliwość usprawnienia tych badań stwarza zastosowanie odpowiednich substratów lub wskaźników w podłożu testowym, powodującym pojawienie się wokół kolonii jasnych stref, wskazujących na występowanie określonej aktywności metabolicznej poszczególnych monokultur.

Rodzaje wstępnego różnicowania:

1. Dodatek do podłoża takich substratów (skrobia, kazeina, czy celuloza) umożliwia obserwację jaśniejszych stref wokół kolonii wytwarzających odpowiednio amylazy, proteinazy czy celulazy.

W przypadku amylaz płytki również można zalać roztworem jodu, w wyniku czego powstają strefy niewybarwione na granatowo, świadczące o rozłożeniu skrobi, natomiast traktowanie płytek z żelatyną kwasem sulfosalicylowym pozwala zwiększyć kontrast jasnych stref na optymalizującym tle, tworzonych przez aktywne proteolitycznie kultury

1. Duże usprawnienie selekcji kultur aktywnych w zakresie określonych biosyntez umożliwia zastosowanie chemicznie modyfikowanych barwnych substratów takich jak: starch – azure, blue-dextran, blue-celulose itp.

2. Wprowadzenie do podłoża selekcyjnego określonych wskaźników, pozwala na szybkie różnicowanie kolonii mikroorganizmów, wytwarzających lub przekształcających wiele zw. chem. Identyfikację kultur wytwarzających kw. organiczne i aminy, umożliwia zastosowanie w testach z użyciem pożywek agarozowych na płytkach Petriego, błękitu bromofenolowego lub czerwieni obojętnej, które zmieniają barwę w określonych przedziałach pH.

1. Doboru kultur aktywnych w zakresie wytwarzania aminokwasów dokonuje się w oparciu o metodę selekcji mutantów regulowanych o zniesionych lub zmienionych mechanizmach represji. W tym celu stosuje się metodę tzw. płytek gradientowych, polegającą na przygotowaniu płytek zwierających podłoża o stopniowo malejącym stężeniu związków toksycznych, które są analogami metabolitów lub prekursorów produktów końcowych.

2. Cenne kultury przemysłowe selekcjonuje się spośród wyrosłych kolonii w strefie dużej koncentracji toksycznego związku. Metoda ta w formie zmodyfikowanej jest przydatna także do selekcji kultur aktywnych podczas degradacji ksenobiotyków. Stosuje się je wówczas jako jedyne źródło węgla i azotu w podłożu selekcyjnym.

3. Identyfikację drobnoustrojów wytwarzających aminokwasy i witaminy można również przeprowadzić stosując metodę auksanografii, a której testowane kolonie (auksotrofy) wysiane na podłoże minimalne, zalewa się warstwą drugiego, z odpowiednio dobranym organizmem testowym. Strefy ich wzrostu wokół badanych kolonii świadczą o wytwarzaniu badanego metabolitu przez kom. drobnoustrojów.

4. Według podobnej zasady selekcjonuje się mikroorganizmy wytwarzające antybiotyki. W tym celu po okresie inkubacji obserwuje się wielkość stref zahamowania wzrostu szczepu testowego, powstałych pod wpływem antybiotyku wydzielanego przez mutanta.

Alternatywną metodą testowania kultur wytwarzających aminokwasy, witaminy i antybiotyki stwarza tzw. metoda krążków agarozowych, polega ona na:

1. Hodowla płytkowa testowalnych kolonii na podłożu agarozowym

2. Sterylne wycięcie z agaru krążków podłoża z testowanymi koloniami

3. Wycięte krążki nanosi się na płytki z drobnoustrojem testowanym

4. Inkubacja

5. Mierzenie stref wzrostu kolonii wokół krążków ze szczepami wytwarzającymi witaminy czy aminokwasy lub zahamowanie wzrostu wokół krążków z kulturami wytwarzającymi antybiotyki.

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu poszukującego nowy antybiotyk.

1. Zastosowanie folii półprzepuszczalnej

1. Zastosowanie podwójnych płytek z przegrodą półprzepuszczalna

1. Metoda bloczków agarozowych

1. Metoda bloczków agarozowych połączona z uzyciem wskaźnika barwnego

1. Wykrycie syntezy nukleaz (DN-azy, RN-azy) umożliwia zastosowanie testów z kwasem solnym, który powoduje zmętnienie w miejscach zawierających niezhydrolizowany kwas nukleinowy. Podobna funkcję pełni test z oranżem akrydyny umożliwiający obserwacje w nadfiolecie fluorescencji w miejscach z nierozłożonym polimerem.

Gdy grzybnia rozpełza się po płytkach stosujemy deoksycholan sodu, który umożliwia rozwój grzybni w skupionej kolonii.

1. W celu wykrycia inhibitorów enzymów często stosuje się substraty zmieniające w wyniku reakcji, barwę lub odczyn środowiska. Do identyfikacji kolonii wytwarzających inhibitory β-laktamaz wykorzystuje się chromogen nitrocefinę (półsyntetyczna cefalosporyna) o żółtej barwie. W wyniku dyfuzji inhibitora i jego reakcji z enzymem, całość pokrywa się druga warstwą agaru, zwierającą nitrocefinę. Po określonym czasie inkubacji wokół kolonii wytwarzających inhibitory β-laktamaz zostaje zachowana niezmieniona strefa barwy żółtej, podczas gdy reszta płytki w wyniku rozkładu nitrocefiny zmienia kolor na czerwony.

Selekcja mutantów auksotroficznych – metoda replik

Metoda ta wykorzystuje zarodniki lub spory. Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z wynikiem pozytywnym, za pomocą posiewu redukcyjnego zostają wyprowadzone czyste kultury, które poddawane są następnie testom fermentacyjnym.

Testy fermentacyjne:

• Oceniają przydatność w przemyśle poszczególnych mikroorganizmów wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych.

• Ich celem jest wybór organizmu przeprowadzającego określony proces biotechnologiczny z największą wydajnością po uwzględnieniu kosztów ekonomicznych związanych z prowadzeniem procesu produkcji wybranego bioproduktu na skalę przemysłową.

• Prowadzone w niewielkich bioreaktorach o pojemności 5-20 l.

• Pozwalają na ustalenie optymalnej metody hodowli badanego mikroorganizmu.

- wybór określonego rozwiązania konstrukcyjnego bioreaktora

- wybór sposobu hodowli (ciągła, dolewowa, okresowa)

- warunki fizyko-chemiczne hodowli

-skład pożywki hodowlanej

Hodowla wzbogacająca:

Hodowla wzbogacająca- jest to metoda opierająca się na wprowadzeniu do próbki badanej ze środowiska związków chemicznych mogących pełnić rolę czynnika selekcyjnego, pozwalającego na zmiany liczebności mikroorganizmów tworzących populacje drobnoustrojów zawartych w badanej próbce, podczas jej inkubacji w określonych warunkach fizykochemicznych tj. temp., czas inkubacji.

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu produkującego β-D-galaktozydazę.

Podłoże selekcyjne zawiera substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-βD-galaktopiranozyd) i indyktor IPTG( izopropylo- βD-galaktopiranozyd).

Czynniki fizjologiczne wpływające na nadprodukcję metabolitów wytwarzanych przez drobnoustroje:

1. aktywność szczepów

2. warunki środowiskowe takie jak:

• skład podłoża,

• jego wartość pH,

• temperatura,

• sposób prowadzenia hodowli

• czas jej trwania

Właściwy dobór tych czynników umożliwia uzyskanie określonych produktów o wydajności, która decyduje o prowadzeniu biosyntezy w szerszej skali.

Pożywki i podłoża hodowlane

Pożywka jest podstawowym czynnikiem wpływającym na proces wytwarzania określonych produktów wytwarzanych przez drobnoustroje.

Pożywka wpływa na:

• wzrost drobnoustrojów poprzez zmniejszanie lub zwiększanie ilości biomasy i produktu biosyntezy

• sprzyjający wpływ na ich powst. bez równoczesnego powiększania biomasy.

Określone enzymy lub metabolity wytwarzane są jedynie wówczas gdy w pożywce znajduje się określony induktor lub pośrednie produkty jego hydrolizy.

W procesach biotechnologicznych wykorzystuje się pożywki:

1. ciekłe (do hodowli auksotrofów, skład: składniki mineralne w proporcjach ustalonych empiryczne uzależnionych od wymagań)

2. stałe (do hodowli heterotrofów, skład jak u auksotrofów ale dodatkowo zawierają związki organiczne)

Rodzaj substancji wykorzystywanych z podłoża i ich stężenie w pożywce zależą od:

• rodzaju i gatunku drobnoustrojów

• wykorzystywania (biomasy, metabolity)

Zmiana składu pożywki może powodować zmianę kierunku metabolizmu komórki. Np. Aspergillus Niger który przy zróżnicowaniu składu pożywki i warunków biosyntezy potrafi syntetyzować całą gamę metabolitów w stosunkowo dużych stężeniach. Uzyskanie maksymalnej wydajności biomasy kom. nie zawsze jest skorelowane z maksymalną wydajnością określonego metabolitu.