Wykład biol mol ze Strzałką nr 2
Wyróżniamy trzy etapy syntezy białka:
Inicjacja – organizowanie się kompleksu rybosomu – mRNA
Elongacja – powtarzalne cykle dostarczania aminokwasów, tworzenia wiązań peptydowych i przemieszczania rybosomu wzdłuż mRNA (translokacja)
Terminacja – uwalnianie łańcucha polipeptydowego
Translacja mRNA zachodzi w kierunku 5’ do 3’.
Pierwszy aminokwas syntetyzowanego polipeptydy zakodowany jest przed kodon leżący bliżej 5’ końca tran skryptu. Najwcześniej wbudowanymi aminokwasami powstającego białka są te, które stanowią jego N- terminalną część. Wynika to z mechanizmu tworzenia wiązań peptydowych między sąsiadującymi aminokwasami.
AUG metionina N-formylometionina przyłączenie –COH do grupy aminowej
Synteza peptydu N C
GUG – walina, UUG – cysteina
IF-1 i IF-3 uniemozliwiają połączenie się podjednostek rybosomu.
5’AGGAG…
Etapy inicjacji biosyntezy białka – Prokariota
Etap I: Białkowy czynnik inicjujący IF-3 wiąże się z podjednostką rybosomu. Zapobiega to reasocjacji zdysocjowanych podjednostek 30S i 50S oraz umożliwia wiązanie mRNA z podjednostką 30S.
Etap II: tRNA inicjatorowy (fMET – tRNA) wiąże się z czynnikiem inicjującym IF-2 oraz GTP. Kompleks ten w obecności czynnika inicjującego IF-1 dołącza się swym antykodonem do pierwszego kodonu mRNA. Powstaje kompleks inicjujący 30S.
Etap III: Po uwolnieniu wszystkich czynników inicjujących przyłącza się podjednostka 50S i powstaje ryboso… zdolny do wydłużania łańcucha polipeptydowego. Jednocześnie następuje hydroliza GTP.
Etap inicjacji:
U Prokariota mRNA, formylometionylo-tRNAf i podjednostka 30S łączą się i tworzą kompleks inicjujący 30S.
Sygnałem „start” na mRNA jest kodon AUG (lub GUG), poprzedzony sekwencja bogatą w puryny, która może parować się z 16S rRNA.
Etapy elongacji łańcucha polipeptydowego:
Etap I: wiązanie aminoacylo-tRNA
Aminoacylo-tRNA przy pomocy czynnika elongacyjnego EF-Tu i GTP zostaje wprowadzony do miejsca A na rybosomie. Po hydrolizie GTP, od rybosomu oddysocjowuje kompleks TF-Tu i GTP.
Etap II: tworzenie wiązania peptydowego
Grupa α-aminowa aminoacylo-tRNA w miejscu A przenosi atak nukleofilowy na zestryfikowaną grupę karboksylową peptydylo-tRNA zajmującego miejsce P. Następuje synteza wiązania peptydowego katalizowana przez transferazę peptydylową, składnik białkowy większej podjednostki.
Etap III: translokacja
Wydłużony peptydylo-tRNA przemieszcza się do miejsca P przy udziale czynnika elongacyjnego EF G (translokazy) i GTP, który hydrolizuje do GDP i P. Miejsce A pozostaje wolne, gotowe do wiązania nowego aminoacylo-tRNA.
Translokacja
Rybosom przesuwa o trzy nukleotydy tak, że następny kodon wchodzi w miejsce A
Dipeptydylo-tRNA przesuwa się z miejsca A na miejsce P
U bakterii deacylowany tRNA przesuwa się z miejsca P na miejsce E (miejsce wyjścia) a u eukariotów jest po prostu usuwany z rybosomu.
Terminacja biosyntezy białka
Zakończenie biosyntezy łańcucha polipeptydowego powodują czynniki uwalniające, które rozpoznają kończące syntezę białka kodony zwane sygnałami stop.
Czynnik uwalniający RF1 rozpoznaje kodony UAA lub UAG
Czynnik uwalniający RF2 kodony UAA lub UGA
Czynnik uwalniający RF3 pomaga w przeprowadzeniu reakcji RF1 i RF2
Wiązanie czynnika uwalniającego z kodonem kończącym, pojawiającym się w miejscu A rybosomu aktywuje transferazę peptydylową tak, że hydrolizuje ona wiązanie między polipeptydem a tRNA zajmującym miejsce P na rybo somie.
Łańcuch polipeptydowy opuszcza rybosom, który dysocjuje na podjednostki 30S i 50S.
Terminacja
Gdy napotkany zostanie kodon STOP w miejsce A wchodzi zamiast tRNA czynnik uwalniający. U bakterii RF-1 rozpoznajde kodony 5’UAA3’ i 5’UAG3’ zaś RF-2 5’UAA3’ i 5;UGA3’, RF3 działa jako czynnik pomocniczy.
Eukarioty mają tylko eRF i uwolnienie peptydu wymaga energii pochodzącej z hydrolizy GTP.
Translacja – podsumowanie
Translacja zachodzi w rybosomach – strukturach rybonukleoproteinowych (RNA : białko)
Sygnałem początku syntezy białka jest kodon AUG, natomiast końca syntezy jeden z kodonów stop – UAA, UAG, UGA.
Synteza białka wspomagana jest przez czynniki białkowe tzw.: inicjacyjne, elongacyjne i terminacyjne.
Translacja jest procesem energochłonnym, czerpiącym energię z hydrolizy GTP i ATP.
Inhibitory translacji
Hamują inicjację (hamują proces przyłączania mRNA i tRNA do małej podjednostki rybosomu) np.: streptomycyna, kanamycyna, neomycyna, gentamycyna
Wiążą się z podjednostką 30S i hamują wiązanie aminoacylo-tRNA do miejsca A oraz unieczynniają białkowe czynniki uwalniające (zapobieganie terminacji) np. tetracykliny
Hamują translokację np. erytromycyna – wiąże się z podjednostką 50S i hamuje translokacje
Hamują aktywność transferazy peptydylowej i podjednostki rybosomalnej 50S:
- u prokariota np. chloramfenikol
- u eukariota np. cykloheksimid
Hamują elongację i powodują przedwczesną germinację syntezy polipeptydu przez … jako analog aminoacylo-tRA np. puromycyna
Różnice występujące u Eukaryota:
Występują rybosomy 80S składające się z podjednostki małej 40S i dużej 60S
Kodon AUG znajdujący się najbliżej końca 5’ mRNA niemal zawsze jest kodonem „start”
Aminokwas inicjujący – metionina – nie ulega formylacji
Etap inicjacji jest bardziej złożony
Czynnik eIF2 jest inaktywowany przez fosforylację, kinazy katalizujące tę inaktywację są kontrolowane.
Inicjacja biosyntezy białka – Eucariota
Pierwszym etapem syntezy białka jest przyłączenie mRNA do mniejszej podjednostki rybosomu (40S) w obecności inicjatorowego tRNA i szeregu czynników inicjacujących. U eukariontów pierwszym kodonem ulegającym translacji jest kodon AUG (tzw. kodon start) kodujący metioninę. Odnalezienie właściwego kodonu start przebiega na drodze skanowania mRNA, gdyż mRNA nie ma sekwencji wiążących rybosom. Ponieważ w mRNA trójek takich może być bardzo wiele, miejsce początku translacji wyznacza ten kodon, który położony jest najbliżej 5’ końca.
W poszukiwaniu pierwszego tj. inicjacyjnego kodonu metioninowego biorą udział czynniki zwane eIF3 i eIF4, z których pierwszy przyłącza do struktury czapeczki kompleks białkowe (tzw. CBP) oraz odszukuje AUG, natomiast drugi – eIF4 dostarcza energii dla poszukiwań. Zanim jednak rybosom ze związanym białkiem eIF3 zacznie kroczyć po mRNA w poszukiwaniu AUG, do podjednostki 40S związany zostaje inicjatorowy aminoacylo-tRNA tj. tRNA niosący czapeczkę aminokwasu – tu metioniny. Gdy przesuwająca się po mRNA podjednostka 40S ze związanym Met-tRNA natrafi na kodon „start” następuje przyłączenie większej podjednostki rybosomu (60S).
Kompleks preinicjacyjny – mała podjednostka rybosomu 40S, inicjatorowy tRNA Met, eIF-2 oraz cząsteczka GTP.
eIF4A i eIF4B mają aktywność helikazy, rozrywają wiązania między parami zasad w obrębie struktur drugorzędowych mRNA odblokowują drogę kompleksowi inicjacyjnemu.
Kompleks inicjacyjny – kompleks preinicjacyjny + mRNA
Skanowanie wymaga energii.
Sekwencja Kozak ACCAUGG
eIF5 pomaga odłączyć pozostałe czynniki
eIF6 jest połączony z dużą niezwiązaną podjednostką rybosomu i zapobiega jej łączeniu z małą podjednostką.
eIF4E + eIF4G + eIF4A = eIF4F
eIF4E – łączy się z czapeczką
eIF4G – łączy się z eIF3
W wyniku tego procesu przyłącza się kompleks preinicjacyjny do mRNA. Dodatkowo na ten proces ma wpływ ogon poliadenylowy, a w oddziaływaniu tym pośredniczy PABI.
Oddziaływanie PABI z eIF4G powoduje zagięcie mRNA.
Funkcje czynników inicjujących u Eukariota
Dostarczające do rybosomów inicjatorowy tRNA: eIF2, eIF2B
(przyłączenie do podjednostki 40S inicjacyjnego aminoacylo tRNA)
Wiążące się z podjednostkami rybosomowymi: eIF6, eIF3, eIF4C
(eIF3-udział w przyłączaniu do 5’ końca mRNA białek CBP. Odszukiwanie kodonu inicjacyjnego. Uniemożliwianie asocjacji podjednostek rybosomowych pod nieobecność innych czynników inicjacyjnych)
Wiążące się z mRNA, które rozpoznają strukturę 5’-kap oraz powodują stopienie jego struktury drugorzędowej: eIF4B i eIF4F
(składa się z eIF4 i eIF4E)
(eIF4 dostarczanie energii niezbędnej w działaniu eIF3 z hydrolizy ATP)
Usuwające inne czynniki: eIF5
(eIF5 – indukcja uwolnienia eIF2 i eIF3 kosztem energii z hydrolizy GTP (związanego z eIF2)).