SEMINARIUM II - METODY ROZDZIAŁU MIESZANIN____________________________________
1. ELEKTROFOREZA
- jest używana do rozdzielania białek (np. z komórek)
- w żelu poliakryloamidowym białka „wędrują” dzięki napięciu elektrycznemu
poprzez pory w żelu
- rozmiar porów zmniejsza się wraz ze zwiększaniem się stężenia akrylamidu
- szybkość migracji białek uzależniona jest od rozmiarów porów w żelu oraz
rozmiarów białek (od natężenia pola elektrycznego, wypadkowego ładunku
cząsteczki białka i wpółczynnika tarcia)
- rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze w żelu, ponieważ żele
działają jak sita molekularne - zwiększają rozdzielczość
- elektroforeza różni się od filtracji żelowej głównie tym, że wszystkie cząsteczki bez
względu na wielkość, migrują przez ten sam nośnik
SDS - roztwór dodecylosiarczanu sodu, w którym rozpuszcza się mieszaninę białek
a. elektroforeza jednowymiarowa - w warunkach denaturujących (1-D SDS-PAGE)
umożliwia rozdzielenie białek ze względu na ich
masę cząsteczkową
- SDS wiąże się do białek w stałej proporcji zależnej
od ich masy cząsteczkowej, nadając wszystkim
białkom ujemny ładunek
- możemy ją wykorzystać do sprawdzenia
wydajności stosowanej procedury izolacji (frakcje
z kolejnych etapów dzielą się na coraz mniej
prążków, aż w końcu pojawi się jeden,
najbardziej intensywny, odpowiadający białku,
które oczyszczamy)
- białka rozdzielane są ze względu na ich masę (SDS-PAGE) lub strukturę
molekularną, rozmiar i ładunek (NATIVE-PAGE - elektroforeza w warunkach
natywnych/niedanuturujących
b. elektroforeza dwuwymiarowa (2D gel electrophoresis)
- rozdziela białka w pierwszym wymiarze przez
fokusowanie (ogniskowanie) izoelektryczne
- następnie rozdziela w drugim wymiarze w
obecności SDS
- uzyskana informacja dotyczy zarówno masy
cząsteczkowej (rozdzielenie w kierunku
pionowym - SDS) i wyjściowego ładunku białka
(ogniskowanie izoelektryczne)
- białka wędrują do miejsc, które odpowiada ich
punktowi izoeletrycznemu (pI)
c. western blotting - używany w celu zidentyfikowania konkretnego białka w
mieszaninie białek
- technika ta wykorzystuje SDS-PAGE w celu rozdzielenia
mieszaniny białek, a następnie zdolność specyficznych
przeciwciał do oddziaływania z konkretnym białkiem
- po poddaniu próbki elektroforezie przenosi się rozdzielone białka
na filtr nitrocelulozowy lub podobny, na którym białko ma lepsze
warunki reakcji z podanym następnie swoistym dla niego
przeciwciałem
- powstały kompleks przeciwciało-antygen można wykryć
przemywając go drugim przeciwciałem, specyficznym dla
pierwszego
2. CHROMATOGRAFIA
- to zbiorcze określenie na zestaw technik laboratoryjnych służących rozdzielaniu
mieszanin
- mieszanina jest rozpuszczona w cieczy nazywanej fazą ruchomą (eluentem), która
przepływa przez fazę stałą, nieruchomą
a. filtracja żelowa (sito molekularne) - pozwala na rozdział cząsteczek ze względu na
ich kształt i wielkość
- faza stacjonarna składa się z mikro-kulek
zbudowanych z nierozpuszczalnego, lecz silnie
uwodnionego żelu, posiadających różnego
rozmiaru pory
- typy żeli: dextran (Sephadex), Agaroza
(Sepharose), Bio-Gel
- małe cząsteczki wnikają do tych mikrokulek
(ziaren) a duże cząsteczki znajdują się tylko w
roztworze wodnym wypełniającym przestrzenie
pomiędzy ziarnami żelu
- najmniejsze cząsteczki opuszczają kolumnę jako
ostatnie
b. chromatografia jonowymienna - pozwala na rozdzielenie składników mieszaniny w
zależności od ich ładunku elektrycznego
- kolumna jest selektywna na typ i siłę ładunku
- złoża anionowe (anionity) posiadają dodatni
ładunek i są używane do wychwytywania
negatywnie naładowanych cząsteczek
- złoża kationowe (kationity) posiadają negatywny
ładunek i są używane do wychwytywania
pozytywnie naładowanych cząsteczek
- białka są rozdzielane ze względu na ich
wypadkowy kierunek
- jeśli białko posiada ładunek dodatni przy pH 7,
zwiąże się do złoża zawierającego grupy
karboksylowe
c. chromatografia powinowactwa - technika rozdziału wykorzystująca specyficzne
oddziaływanie cząsteczek fazy ruchomej z
cząsteczkami fazy stacjonarnej (duże
powinowactwo wielu białek do specyficznych
grup chemicznych)
- istniejące oddziaływania są podobne do
występujących w reakcji przeciwciało-antygen
- mieszaninę białka przesącza się przez kolumnę
wypełnioną nośnikiem, do którego zostały
przyłączone specyficzne sekwencje DNA
- białka wykazujące duże powinowactwo do tych
sekwencji będą zatrzymywane na kolumnie
- etapy procedury : - kowalencyjne przyłączenie
grupy X lub jej pochodnej do
nośnika kolumny
- nałożenie mieszaniny białek
na kolumnę i przemywanie
jej w celu usunięcia białek z
nią niezwiązanych
- eluacja białek nas
interesujących dużymi
stężeniami rozpuszczalnej
formy grupy X lub poprzez
zmianę warunków w celu
zmniejszenia
powinowactwa wiązania
3. HPLC - wysokosprawna chromatografia cieczowa (High-Performance Liquid
Chromatography)
- „ulepszona wersja metod kolumnowych”
- materiały wypełniające kolumnę są znacznie bardziej rozdrobnione, wskutek czego
zawierają więcej miejsc oddziaływania, a zatem i większą zdolność rozdzielczą
- konieczne jest zastosowanie wysokiego ciśnienia - wysoka rozdzielczość i szybki
rozdział
- wykorzystuje różne rodzaje faz stacjonarnych (sorbenty), zawarte w kolumnach
- ponadto zawiera pompę, która przesuwa fazę ruchomą, oraz różnego typu
detektory pozwalające analizować eluat
- pozwala na analizę czasów retencji (czas potrzebny do przejścia przez całą
długość fazy rozdzielczej określonego składnika analizowanej mieszaniny)w
zależności od siły interakcji z fazą stacjonarną
- zależy to od rodzaju analitu, rodzaju fazy stacjonarnej, szybkości przepływu i
rozmiarów kolumny
4. PRECYPITACJA/SOLUBILIZACJA
- metoda rozdziału mieszanin opierająca się na różnej rozpuszczalności białek w
wysokich stężeniach soli (siarczan sodu, siarczan magnezu itp.)
- procesu precypitacji używa się również do zagęszczania białek
- w celu usunięcia soli, możemy stosować dializę
- zwykle proces nie wpływa na strukturę białek, jest w pełni odwracalny
- sól nie denaturuje białek
5. WIROWANIE/ULTRAWIROWANIE
- proces, który wykorzystuje siłę odśrodkową do oddzielenia mieszaniny cząstek o
różnej gęstości
- osad cięższych elementów pozostaje na dnie probówki
- cząsteczki o niższych masach/gęstości pozostaną w roztworze w fazie ciekłej,
zwanej supernatantem
- szybkość wirowania określona jest przez przyspieszenie kątowe przyłożone do
próbki, zazwyczaj mierzone w stosunku do pola grawitacyjnego ziemi
- wirówka jest zoptymalizowana do wirowania z prędkością ok. 12 000 obrotów na
minutę
- ultrawirówki są zoptymalizowane do wirowania przy bardzo dużych prędkościach
(ok. 19 600 km/s2), zdolnych do generowania przyspieszenia aż 2000000
- Svedberg (S;Sv) - jednostka używana dla współczynników sedymentacji
- charakteryzuje zachowanie cząstek w procesie sedymentacji,
wirowania
- technicznie jest miarą czasu i jest zdefiniowany jako dokładnie
10−13s
- substancja o współczynniku sedymentacji 26Sv będzie
podróżować 26mikronów na sekundę pod wpływem
przyspieszenia 1000000
- Svedberg to najważniejszy środek używany do odróżnienia
rybosomów