IMMUNOLOGIA

WYKŁAD 1

1. Nobliści:

• Emil Adolf von Behring – zastosowanie seroterapii w leczeniu błonicy

• Robert Koch – prątki gruźlicy w Wolsztynie

• Paul Ehrlich i Ilya Mechnikowa – odkrycie podstaw mechanizmów efektorowych: fagocytoza (zauważenie makrofagów u szkarłupni

• Charles Robert Richet – odkrycie zjawiska anafilaksji

• Jules Bordet – odkrycie dopełniacza – nieswoista odpowiedź immunologiczna oraz odkrycie pałeczek krztuśca

• Karl Landsteiner – odkrycie antygenów grupowych krwi ABO

• Gerald M. Edelmann, Rodney R. Porter – badanie struktury przeciwciał

• Baruj Benacerraf, Jean Dansset, George D. Snell – badania nad strukturami powierzchniowymi regulującymi odpowiedź immunologiczną

• Niels Jerne, George Kohler, Cesar Milstein – produkscja przeciwciał monoklonalnych

• Susumu Tonegawa – twórca molekularnych podstaw zmienności przeciwciał

• Joseph Murray, Donnall Thomas – immunologia przeszczepu

• Peter Doherty, Rolf Zinkernagel – zjawiska ze swoistą odpowiedzią immunologiczną

• Ludwik Hirszfled – był brany pod uwagę do nagrody, twórca Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu. Współodkrywca antygenów grupowych układu ABO

1. Podstawy funkcjonowania układu odpornościowego

1. definicja:

immunologia – nauka, która bada sposoby obrony organizmu przed czynnikami patogennymi lub wewnętrznymi (np. czynniki nowotworowe) posługując się odpowiednimi mechanizmami efektorowymi.

Układ immunologiczny istnieje po to, aby zwalczać drobnoustroje wnikające do organizmu:

• robaki pasożytnicze

• pierwotniaki

• grzyby

• bakterie: E. coli, Staphylococuss

• wirusy: polio, ospa, grypa, HBV, HIV

1. tytułem wstępu:

• obrona organizmu przed drobnoustrojami może mieć charakter swoisty lub nieswoisty

• odporność nieswoista

• ma charakter natychmiastowej reakcji na różne czynniki zakaźne

• biorą w niej udział komórki fagocytujące: makrofagi, neutrofile, wieloskładnikowy układ dopełniacza oraz inne rozpuszczalne białka (lizozym, laktoferyna)

• o jej skuteczności decydują także bariery fizyczne i chemiczne w ustroju (np. ciągłość nabłonków, pH skóry i przewodu pokarmowego)

• w rozpoznaniu drobnoustrojów kluczową rolę odgrywają receptory Toll-podobne (TLR) – są przedstawicielami zróżnicowanej rodziny receptorów, znanej jako receptory rozpoznające wzorce (PRR) [komórki posiadające te receptory rozpoznają za ich pomocą określone, powtarzające się struktury drobnoustrojów, tzw. wzorce molekularne związane z patogenami PAMPs]

• wykorzystuje mechanizm fagocytozy i bakteriobójcze mediatory

• jeśli mechanizmy te zwiodą, mediatory i komórki odpowiedzi nieswoistej (efekt rozpoznania PAMPs przez PRR) instruują komórki odpowiedzi swoistej czy warto reagować na dany antygen, co decyduje o charakterze indukowanej odpowiedzi

• odporność swoista

• pojawia się jedynie u kręgowców

• swoistość zapewniają klonalne receptory limfocytów T i B lub też określone produkty limfocytów B

• posiada zdolność do rozpoznawania każdej praktycznie determinanty antygenowej (epitopu, czyli fragmentu złożonych antygenów – białek, wielocukrów, lipidów)

• potrafi także rozpoznawać antygeny własnego ustroju!

1. Komórki biorące udział w odpowiedzi immunologicznej

KOMÓRKI UKLADU IMMUNOLOGICZNEGO

komórki immunologiczne (pochodzące ze szpiku) komórki zrębu

• limfocyty (B, T, NK) grasica pozostałe narzą

• makrofagi

• granulocyty i komórki tuczne

• komórki prezentujące antygen

• komórki dendrytyczne

• komórki Langerhansa

• makrofagi

• leukocyty - elementy morfotyczne krwi. 5-9 tysięcy

• są niemal bezbarwne i mniej liczne od erytrocytów,

• posiadają zdolność ruchu

• żyją od kilku dni (granulocyty) nawet do 20 lat (limfocyty B pamięci immunologicznej)

• ich zadaniem jest ochrona organizmu przed patogenami takimi jak wirusy i bakterie.

• wszystkie leukocyty wykazują ekspresję cząsteczki CD45.

• ich liczba waha się od 4×10⁹ do 10×10⁹ w litrze krwi (podając inaczej: 4–10 tys./mm³ lub 4–10 G/L)

• są większe od krwinek czerwonych

• w ich komórkach występuje jądro (mają swój własny metabolizm i możliwość podziału)

• u dużej części krwinek białych (granulocyty) w cytoplazmie występuje charakterystyczna ziarnistość (są to np. lizosomy, które zawierają enzymy)

• Leukocyty są podstawowym elementem układu odpornościowego. Ich funkcja odpornościowa jest realizowana przez:

  • fagocytozę (pochłanianie, trawienie komórek drobnoustrojów oraz martwych krwinek czerwonych przez część krwinek białych)

  • odporność swoistą (produkcja przeciwciał oraz reakcja limfocytów T)

  • degranulację i produkcję rodników

• Leukocyty dzielą się na:

  • agranulocyty – w skład których wchodzą:

• limfocyty 28-42%

• monocyty4-8% - Monocyty są największymi z leukocytów. Posiadają duże jądro, fasolowate oraz wytwarzają interferon. Monocyty mają dużą zdolność do fagocytozy. Gdy dojrzeją przekształcają się w makrofagi i przenikną do tkanek z obwodu.

  • granulocyty – w skład których wchodzą:

• neutrofile 45-65% - (granulocyty obojętnochłonne) zapewniają ochronę przed drobnoustrojami na drodze fagocytozy, są wytwarzane intensywnie podczas stanów zapalnych. Posiadają jądra podzielone na segmenty (2-5). Poruszają się ruchem pełzakowatym. Są odpowiedzialne za wytwarzanie ropy. Żyją 2–4 dni, umierają od zatrucia bakteriami. Nadmiar może świadczyć o szpiczaku

• eozynofile 2-4% - (granulocyty kwasochłonne) są odpowiedzialne za niszczenie obcych białek np. alergenów. Są intensywnie wytwarzane podczas zarażenia pasożytem. Poruszają się ruchem pełzakowatym i fagocytują. Są odpowiedzialne za niszczenie larw i jaj pasożytów. Mają jądro okularowe. Eozynofile regulują procesy alergiczne – powodują, że alergia jest łagodniejsza.

• bazofile 0,5-1% -(granulocyty zasadochłonne) posiadają zdolności do fagocytozy (mniejszą niż neutrofile)^[3]. Nie poruszają się ruchem pełzakowatym. Produkująinterleukinę 4, która pobudza limfocyty B oraz heparynę i serotoninę.

1. Limfocyty:

• główne komórki układu odpornościowego

• mają zdolność swoistego rozpoznawania przez specyficzne receptory różnych determinant antygenowych

• małe, jądrzaste komórki z niewielką ilością cytoplazmy

• są komórkami wysoce wyspecjalizowanymi, których różnicowanie na określonej subpopulacje związane jest z dwoma cechami: swoistością dla antygenu i funkcją w układzie immunologicznym

• każda subpopulacja posiada na powierzchni swoiste antygeny różnicowania, warunkujące jej fenotyp

• limfocyty kompetentne immunologicznie – takie, które posiadają zdolność swoistego rozpoznania antygenu lub też swoistej odpowiedzi na niego

• komórki efektorowe – komórki zaangażowane w odpowiedź immunologiczną wytwarzające przeciwciała oraz uczulone limfocyty T biorące aktualnie udział w reakcjach komórkowych (np. odrzucanie przeszczepu)

• klon limfocytów – grupa komórek powstałych przez proliferację i różnicowanie pod wpływem antygenu z jednej immunologicznie kompetentnej komórki macierzystej (w skład klonu mogą wchodzić zarówno komórki kompetentne jak i efektorowe)

• Dzielą się na:

• limfocyty LGL - duże ziarniste limfocyty, w których skład wchodzą komórki NK – pełnią te same funkcje co limfocyty T-cytotoksyczne, lecz ich zabijanie jest inaczej zapoczątkowane

• limfocyty B – znacznie mniejsza populacja, odpowiadająca za reakcję typu humoralnego, w której biorą udział przeciwciała produkowane przez komórki plazmatyczne; powstają w szpiku kostnym

• limfocyty T – jest ich najwięcej, dojrzewają w grasicy gdzie edukują się i następuje ich selekcja (70% limfocytów) oraz podział na subpopulacje. Są odpowiedzialne za reakcje typu komórkowego, gdyż produkują cytokiny. Posiadają receptory TCR (rozpoznają obce antygeny)

• limfocyty Th – stymulują limfocyty B do wytwarzania przeciwciał, rozpoznają toksyny bakteryjne, aktywują makrofagi, wykazują ekspresję białka powierzchniowego CD4 wiążącego się z MHC II

• limfocyty Tc – zabijają komórki zakażone wirusami i nowotworowe w wyniku efektu cytotoksycznego. Wykazują ekspresję białka powierzchniowego CD8 wiążącego się z MHC I

• limfocyty Treg – kontrolują aktywność pozostałych limfocytów i innych komórek układu immunologicznego. Wykazują ekspresję CD8

1. Porównanie Limfocytów T i B

Rodzaj	Limfocyty B	Limfocyty T
Miejsce dojrzewania	Szpik kostny	Grasica
Receptor dla antygenu	Przeciwciało	TCR
Podlegają restrykcji MHC	Nie	Tak*
Charakterystyczne markery	Pow. Ig, CD19, CD20, CD21, CD79	TCR/CD3, Th-CD4, Tc-CD8
Umiejscowienie w węzłach chłonnych	Ośrodki namnażania	Strefa przykorowa
Komórki pamięci	Tak	Tak
Funkcja	Ochrona przed patogenami zewnątrzkomórkowymi	Ochrona przez patogenami wewnątrzkomórkowymi
Produkty	Przeciwciała	Cytokiny: Th1 – IFN ϒ/ IFN α; Th2-IL4, IL-5, IL-6 Tc - perforyny

*Antygen musi być związany z MHC, następuje jego prezentacja limfocytom T. Limfocyty B nie są tak wymagające. Ich receptor immunoglobulinowy może wiązać na powierzchni antygen

Liczba Limfocytów T pomocniczych związana jest z HIV – im mniej ich, tym mniej CD4 <200/ul krwi. Występuje też przy białaczce i innych chorobach z wzmożoną krwiotwórczością (chłoniaki)

Po wykonaniu swojej funkcji efektorowej, kiedy przestaną być potrzebne i infekcja gaśnie mogą być niebezpieczne (jest ich bardzo dużo). Dlatego istnieją mechanizmy eliminacyjne. Komórek które posiadają zdolność rozpoznania antygenu patogenu jest bardzo mało i są namnażane. Częśc z nich przeżywa i nazywane są komórkami pamięci, które w odpowiednim momencie są znów zdolne do odpowiedzi immunologicznej.

1. Limfocyty T i B receptory powierzchniowe – na skutek procesu rearanżacji genów kodujących receptory obu populacji, cechuje je ogromna różnorodność

1. Limfocyty B

• ich receptory BCR rozpoznają antygeny bezpośrednio

• są identyczne z immunoglobulinami wytwarzanymi przez różnicujące się z tych limfocytów komórki plazmatyczne

• w skład podstawowej jednostki immunoglobuliny wchodzą: dwa łańcuchy ciężkie (H) i dwa łańcuchu lekkie (L)

• immunoglobuliny różnią się w szczegółach budowy, co pozwala je zaliczać do określonych odmian, nazywanych izotypami (IgM, IgG, IgA, IgD, IgE)

• łańcuchy H i L składają się z części stałych i zmiennych – te ostatnie są odpowiedzialne za swoiste rozpoznanie antygenu i związanie się z nim

1. Limfocyty T

• posiadają receptory antygenowe TCR

• są one heterodimerami łańcuchów α i β albo ϒ i δ, które są strukturalnie spokrewnione z immunoglobulinami i również posiadają część zmienną i stałą

• limfocyty z łańcuchami αβ rozpoznają antygeny nie bezpośrednio, lecz tylko gdy połączone są z antygenami transplantacyjnymi głównego układu zgodności tkankowej MHC HLA

• antygeny są rozpoznawane dopiero po przygotowaniu – fragmentacji z wykorzystaniem enzymów, przez specjalną klasę komórek prezentujących antygen ACP, do których zaliczamy m.in. makrofagi i lim B

• inaczej traktowane są antygeny zewnętrzne sfagocytowane przez ACP, które na powierzchni komórek są eksponowane z MHC klasy II, a inaczej antygeny wewnątrzkomórkowe znajdujące się w cytoplazmie, prezentowane przez MHC klasy I – mechanizm ten to restrykcja MHC

• determinują one niepowtarzalną indywidualność antygenową

1. Parę definicji:

1. antygen – substancja obca, która wprowadzona do drobnoustroju wiąże się z przeciwciałami lub receptorami limfocytów T i wywołuje reakcję immunologiczną skierowaną swoiście przeciwko niej

2. determinanta antygenowa (epitop) – ugrupowanie chemiczne na antygenie, które decyduje o właściwościach antygenu i jego wysokiej swoistości

3. cytokiny – peptydy i białka produkowane przez wiele komórek, głównie należących do układu immunologicznego. Regulują proliferację, różnicowanie i aktywność komórek oraz ich rozpoznawanie w reakcjach immunologicznych

4. MHC – główny kompleks zgodności tkankowej – antygeny występujące na powierzchni komórek organizmu, warunkujące wzajemne ich rozpoznanie i biorące udział w prezentowaniu obcego antygenu

• MHC klasy I – występują na powierzchni wszystkich komórek organizmu (prezentują antygeny wytworzone wewnątrz komórki, stanowią podstawę odróżnienia antygenów własnych od obcych)

• MHC klasy II – występują na powierzchni komórek układu immunologicznego np. limfocytów, komórek dendrytycznych (prezentują antygeny dostające się do komórki z zewnątrz np. toksyny bakteryjne)

1. Reakcje efektorowe

Reakcje efektorowe mogą być wynikiem bezpośredniego działania samych limfocytów T i ich mediatorów (cytokin) lub też współpracujących z nimi innych komórek (limfocytów B, makrofagów, bazofilów, eozynofilów.

• uruchomienie odpowiedniej reakcji umożliwiającej zniszczenie lub inaktywację antygenu zachodzi na poziomie limfocytów pomocniczych Th. Wyróżnia się trzy rodzaje tych limfocytów:

• Th1 – syntetyzują interferon gamma i interleukinę 2 IL-2

• Th2 – IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13

• Th17 – wydzielają IL-17

• limfocyty B mogą być aktywowane do produkcji przeciwciał przez limfocyty Th2, a w syntezie niektórych izotypów biorą też udział Th1

• pewne antygeny stymulują limfocyty B bezpośrednio – antygeny T-niezależne

• przeciwciała IgM i IgG aktywują układ dopełniacza, co w przypadku przyłączenia komórki Ig do komórki bakteryjnej (opsonizacja) prowadzi do destrukcji i ułatwia fagocytozę

• IgE łączą się z mastocytami i bazofilami co powoduje degranulację komórek i uwolnienie intermediatorów (np. histaminy)

• Odpowiedź komórkowa obejmuje trzy rodzaje reakcji:

• limfocyty Tc w procesie odpowiedzi cytotoksycznej uszkadzają w sposób antygenowo swoisty komórki celowe (np. komórki obcego przeszczepu, komórki zakażone wirusem)

• podczas reakcji komórkowych limfocyty Th1 ulegają aktywacji pod wpływem antygenu, a ich mediatory, limfokiny i różne interakcje międzykomórkowe pobudzają makrofagi, co znacznie zwiększa ich zdolność do zabijania sfagocytowanych bakterii

• limfocyty Th17 za pośrednictwem uwalnianej IL-17 aktywują neutrofile do zabijania drobnoustrojów

1. Regulacja odpowiedzi immunologicznej

• komórki biorące udział w odpowiedzi immunologicznej komunikują się ze sobą przez bezpośredni kontakt lub przez wydzielane mediatory (cytokiny), dla których posiadają odpowiednie receptory

• interakcje te mogą mieć charakter pozytywny prowadzący do zwiększenia odpowiedzi lub negatywny – hamujący ją

1. Pamięć immunologiczna:

• układ immunologiczny posiada pamięć uprzedniego zetknięcia z danym antygenem

• proliferujące pod wpływem antygenu limfocyty T i B różnicują się w większości w komórki efektorowe, jednak część z nich wraca do stanu spoczynkowego, stanowiąc pulę komórek pamięci

• przy pierwszym zetknięciu w odpowiedzi humoralnej są głównie wytwarzane IgM. natomiast w odpowiedzi wtórnej głównie IgG – odpowiedź jest szybsza i bardziej efektywna

• zjawisko to wykorzystuje się do szczepień ochronnych

• odpowiedź naturalna – wrodzona nie posiada mechanizmu pamięci i jest stale uruchamiana od nowa

1. Cząsteczki uczestniczące w nieswoistych mechanizmach odpornościowych:

1. dopełniacz

   • układ około 30 białek enzymatycznych działających w sposób kaskadowy na drodze:

• alternatywnej

• klasycznej

• lektynowej

  • Funkcje:

• współpraca z odpowiedzią swoistą

• wzmaga odpowiedź humoralną i rozwój pamięci immunologicznej

• niektóre uwalniane czynniki powodują chemotaksję (przyciągnie neutrofilów do miejsca ataku drobnoustrojów, stan zapalny, naciek limfocytów) i aktywację leukocytów oraz wykazują właściwości opsonizacyjne (wzmaganie wiązania między bakterią i fagocytem)

• zabijanie drobnoustrojów na skutek aktywności kompleksu atakującego błonę (perforacja błony i wniknięcie do środka substancji chemicznych)

  • Efekt końcowy:

• działanie kompleksu atakującego błonę i utworzenie poru w ścianie atakowanej komórki na skutek czego komórka ginie, a układ dopełniacza uczestniczy w: obronie przeciwzakaźnej, usuwaniu zbędnych produktów (kompleksy immunologiczne, komórki apoptotyczne)

1. białka ostej fazy

   • grupa białek surowicy krwi syntetyzowanych przez hepatocyty wątroby, których stężenie we krwi zmienia się w wyniku odpowiedzi na stan zapalny - jest to tzw. odpowiedź ostrej fazy.

   • W przebiegu procesów zapalnych komórki zapalne (głownie neutrofile i makrofagi) uwalniają mediatory stanu zapalnego, w tym interleukiny IL-1, IL-6, IL-8 i TNF-α, co prowadzi do wzrostu syntezy pewnych białek oraz spadku produkcji innych.

   • W związku z tym białka ostrej fazy dzieli się na pozytywne i negatywne.

   • Funkcja:

• wzmaganie aktywacji dopełniacza

• opsonizacja mikroorganizmów

• ograniczenie uszkodzeń tkanek powodowanych przez bakterię

1. Interferony IFN-α, IFN-β, IFN-ϒ

• IFN-α i IFN-β są syntetyzowane I uwalniane przez komórki zarażone wirusem

• IFN – ϒ jest produkowany przez limfocyty T i NK, ma działanie przewiwirusowe:

• prowadzi do degradacji wirusowego mRNA, a IFN-alfa i beta hamują rozpoczęcie syntezy białek wirusowych

• wzmaga ekspresję cząsteczek MHC, aktywuje makrofagi, stymuluje fagocytozę

• wzmaga cytotoksyczność poprzez komórki NK, K i aktywację limfocytów Tc

• działa stymulująco na eskpresję niektórych cytokin (IL-6, IL-1 czy TNF)

1. fagocytoza

• w procesie uczestniczy grupa komórek fagocytujących (neutrofile, monocyty, makrofagi)

• wykazują one zdolność do niespecyficznego rozpoznania i wiązania składnika obcego dla organizmu, głównie drobnoustrojów

• aktywowana komórka fagocytująca poprzez odpowiednie receptory rozpoznaje bezpośrednio odpowiednie struktury w ścianie bakterii albo czynniki opłaszczające komórkę bakteryjną (opsoniny: przeciwciała, składniki C1 i C3 dopełniacza, białko C-reaktywne, kolektyny)

• obca cząsteczka po sfagocytowaniu (wchłonięcie i fuzja z lizosomem) jest zabijana w fagolizosomach przez:

• układ enzymów hydrolitycznych

• reaktywne rodniki tlenowe

• NO

• laktoferynę

1. komórki NK

• filogenetycznie najstarsza i najmniej ruchliwe limfocyty, CD 56+

• czynnikiem wzrostu dla nich jest IL-1 i IL-2

• efekt działania komórek NK nie podlega restrykcji MHC

• komórki NK poprzez wydzielane przez siebie cytokiny:

• regulują dynamikę odpowiedzi immunologicznej wpływając na proliferację, różnicowanie i dojrzewanie innych komórek

• w sieci interakcji komórkowych wpływają hamująco na odpowiedź humoralną m.in. poprzez wzrost wydzielania IFN – gamma, który jest czynnikiem supresorowym dla proliferacji komórek B

1. Niektóre enzymy i czynniki ułatwiające degradację:

• lizozym – glikozydaza obecna w neutrofilach, monocytach, osoczu krwi, łzach ślinie, należy do grupy enzymów hydrolizujących

• elastaza – enzym proteolityczny, degraduje elastynę, główny składnik tkanki łącznej

• czynnik bakteriobójczy BPI – jest białkiem kationowym granulocytów

• laktoferyna – wiąże jony żelaza, niezbędne do wzrostu bakterii

• białko bogate w prolinę – jedno z głównych białek śliny, łączy się z bakteriami jamy ustnej

FUNKCJE:

• działanie bakteriobójcze, głównie na gramdodatnie

• ułatwia penetrację składników układu odpornościowego w głąb tkanek

• zwiększa przepuszczalność dla cząsteczek hydrofobowych

• wykazuje działanie bakteriostatyczne

• hamuje ruchliwość bakterii

1. rozpoznanie struktur PAMP poprzez receptory

• komórki odpowiedzi nieswoistej rozpoznają struktury drobnoustrojów, nazywane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami PAMP. Wśród nich wyróżnia się receptory rozpoznające wzorce PRR i Toll – podobne oraz m.in. białko wiążące mannozę, kolektyny, defenzyny

• EFEKT:

• eliminacja agresora

• zahamowanie biosyntezy składników ściany komórkowej lub wnętrza

• zainicjowanie odpowiedzi zapalnej, rozpoczęcie wytwarzania interferonów i innych mediatorów zapalnych

• aktywacja klasyczna dopełniacza lub fagocytozy

1. Antygeny

1. cechy:

• immunogenność – zdolność do wywołania przez siebie odpowiedzi immunologicznej skierowanej swoiście przeciwko sobie. Uwarunkowana przez kilka czynników:

• antygen musi zawierać determinanty antygenowe normalnie niewystępujące w ustroju uodparnianym, a więc rozpoznawane jako obce

• cząsteczka antygenu musi mieć odpowiednią wielkość

• antygenowość – zdolność do swoistego łączenia się z immunoglobulinami (zarówno wolnymi, jak i stanowiącymi receptory limfocytów T i B

1. hapteny:

• Antygeny wykazujące tylko antygenowość

• proste związki chemiczne (glukoza, leki, aspiryna)

• immunogenność zyskują dopiero po połączeniu z nośnikiem białkowym

1. determinanta antygenowa

Przeciwciała (uwalniane receptory limfocytów B) powstające pod wpływem antygenu skierowane są nie przeciwko całej cząsteczce, lecz przeciw pewnym jej fragmentom, tzw. determinantom antygenowym (epitopom)

• są to także miejsca rozpoznawane przez limfocyty T

• liczba epitopów uwarunkowana jest wielkością cząsteczki antygenu, z czego część znajduje się na jego powierzchni, a część wewnątrz (determinanty ukryte), które mogą być wykazane dopiero po rozwinięciu globularnego antygenu lub jego enzymatycznym rozkładzie

• antygen wielodeterminantowy może posiadać określoną liczbę identycznych chemicznie determinant lub kilka różnych, z których każda indukuje powstanie swoistych dla niej przeciwciał. Reagują one z całą cząsteczką antygenu

• epitop ciągły – determinanty złożonr x szeregu kolejnych aminokwasów jednej nici polipeptydowej (sekwencyjne) lub przez przyłączenie haptenu w określonym miejscu łańcucha – wykrywane przez limfocyty T i B

• epitop nieciągły – determinanty przestrzenne utworzone przez kilka aminokwasów znajdujących się blisko siebie, ale nie ułożonych kolejno i niekoniecznie na jednym łańcuchu – limfocyty B

1. antygeny T-zależne i T-niezależne

• przeciwciała wytwarzane przez limfocyty B

• antygeny, które mogą bezpośrednio indukować produkcję przeciwciał nazywane są T-niezależnymi; nie mają z reguły charakteru białkowego, najczęściej posiadają znaczną liczbę powtarzających się determinant polisacharydowych, lipidowych lub polinukleotydowych, a wywołana przez nie odpowiedź humoralna stymuluje głównie do wytwarzania IgM. Większość nie wywołuje odpowiedzi komórkowej

• T-niezależne TI-1 – zwiększają w sposób nieswoisty (poliklonalny) proliferację limfocytów B

• T-niezależne TI-2 – nie działają mitogennie

• te zaś, które wymagają pośrednictwa limfocytów T – T-zależnymi

1. Rodzaje odporności

1. nieswoista - oparta jest na mechanizmach wcześnie powstałych w filogenezie i istniejących u wszystkich organizmów wielokomórkowych. Ten typ odpowiedzi stanowi pierwszą linię obrony organizmów przed patogenami. Jej mechanizmy mogą działać od razu po zetknięciu z antygenem i często wystarczają do zwalczenia patogenu. Niemniej jednak ich działanie nie jest tak precyzyjne jak w przypadku mechanizmów swoistych i nie zawsze daje możliwość usunięcia obcych antygenów

• udział:

• fizyczne i chemiczne bariery

• lizozym

• białka ostrej fazy

• układ dopełniacza

• cytokiny (chemokiny)

• fagocyty (granulocyty, makrofagi)

• NK, komórki tuczne i dendrytyczne

• cechy: szybka, pewne cechy swoistości, brak pamięci

• najważniejsze mechanizmy:

• wydzielanie cytokin prozapalnych przez aktywowane fagocyty

• wydzielanie czynników chemotaktycznych zwabiających limfocyty

• prezentacja antygenów przez makrofagi

• pobudzanie limfocytów poprzez działające nieswoiście białka (np. defensyny)

1. swoista - gałąź odpowiedzi odpornościowej, w której główną rolę odgrywają mechanizmy swoiste. Ponieważ jedynymi komórkami, które są odpowiedzialne za specyficzne rozpoznanie antygenu są limfocyty, odpowiedź swoista jest uzależniona właśnie od ich działania. Podstawą rozwoju odpowiedzi swoistej są zjawiska prezentacji antygenu oraz selekcji klonalnej, pozwalają one bowiem na wyodrębnienie z puli wszystkich limfocytów jedynie tych, które mogą rozpoznawać dany antygen.

• Należy podkreślić, że wyodrębnianie odpowiedzi swoistej i nieswoistej jest, w świetle dzisiejszych badań, jedynie swego rodzaju umową. Można wprawdzie wyodrębnić limfocyty, ale z jednej strony, rozwój odpowiedzi swoistej jest niemożliwy bez udziału czynników nieswoistych, takich jak dopełniacz, czy też nieswoiście działających komórek, takich jak neutrofile czy makrofagi. Z drugiej strony, przeciwciała oraz limfocyty Th, działające swoiście, wykazują także silny wpływ na odpowiedź nieswoistą.

• Mechanizm:

• działanie przeciwciał i limfocytów B

• aktywność limfocytów T pomocniczych

• aktywność limfocytów T cytotoksycznych

• Inne populacje limfocytów, np. limfocyty NKT, mogą stać na pograniczu odpowiedzi swoistej i nieswoistej. Zawsze jednak pamiętać należy o umownym znaczeniu pojęcia odpowiedzi swoistej.

• cechy: zapoczątkowanie wymaga dłuższego czasu, duża swoistość, pamięć

• komórki: limf T i B

• cząsteczki: przeciwciała, cytokiny

1. Wzajemne oddziaływanie odporności nabytej i wrodzonej

• makrofagi produkują cytokiny indukujące odpowiedź nabytą

• składowe dopełniacza są aktywowane przez przeciwciała

1. Układ odpornościowy odpowiedzialny za rozwój odporności nabytej:

1. centralne (pierwotne):

• grasica

• szpik kostny

Powstają u dojrzewają komórki układu odpornościowego – wyedukowane komórki wędrują na obwód

1. obwodowe (wtórne):

• węzły chłonne rozsiane po całym organizmie

• śledziona

W tych narządach następuje rozpoznanie antygeny i kształtuje się odpowiedź na nie (proliferacja i różnicowanie się limfocytów)

1. Szpik kostny

• We wczesnym okresie życia płodowego zastępują go inne narządy:

pęcherzyk żółciowy wątroba śledziona

• odpowiada za rozwój komórek linii mieloidalnej (macierzyste) oraz limfoidalnej, skąd wędrują do grasicy, gdzie dojrzewają limfocyty B

1. Grasica

• leży w klatce piersiowej na sercu i głównych naczyniach krwionośnych

• jest narządem dwupłatowym, podzielonym na płaciki rozdzielone beleczkami tkanki łącznej

• wyróżniamy w niej korę(gęsto upakowana niedojrzałymi tymocytami) i rdzeń (dojrzałe tymocyty)

• odpowiada za edukację tymocytów; eliminowanych jest około 90% limfocytów, które tu dotrą (te, które wykazują bardzo silne lub bardzo słabe powinowactwo do tkanek)

• najmniejsza aktywność w okresie życia płodowego i przed okresem dojrzewania – później następuje jej inwolucja

  • selekcja pozytywna w korze – tymocyty uczą się rozpoznawać własne antygeny zgodności tkankowej MHC I i MHC II

  • selekcja negatywna w rdzeniu – tymocyty uczą się tolerancji wobec własnych antygenów (białek, hormonów, komórek) odróżniania co własne, a co obce. Tymocyty, które nie rozpoznają MHC lub reagują na antygeny własne są eliminowane na drodze apoptozy

1. Śledziona

• duży, otorbiony narząd, fasolowaty

• wnika do niej tętnica śledzionowa

• stanowi biologiczny filtr krwi, eliminuje z krążenia komórki uszkodzone i stare erytrocyty oraz wytwarza odpowiednie środowisko dla rozwoju odpowiedzi immunologicznej

• wyróżniamy dwa obszary

• miazga biała - skupiska limfocytów tworzące wokół tętnic centralnych pochewkę PALS

• miazga czerwona – układ naczyń włosowatych, zatokowych pomiędzy którymi występują komórki tworzące sznury śledzionowe

1. Węzły chłonne

• leżą na przebiegu naczyń limfatycznych, filtrują chłonkę i stwarzają odpowiednie środowisko dla rozwoju odpowiedzi immunologicznej (kom dendrytyczne prezentują rozpoznany antygen limfocytom T i B)

• mają kształt nerkowaty, otoczone torebką łącznotkankową

• po torebką łącznotkankową zatoka brzeżna kora (wiele grudek limfatycznych z Limf B i kom dendrytycznymi) strefa przykorowa (grasiczozależna, gromadzi głównie limfocyty T) rdzeń

1. Tkanki limfatyczne związane z błonami śluzowymi:

1. nosa – NALT

• składa się z migdałków gardłowych i pierścieni Waldeyera (podniebienie)

• zatrzymują mikroorganizmy z powietrza – wciągają je do głębokich bruzd

• podobne do węzłów, ale nie mają naczyń odprowadzających

1. układu pokarmowego – GALT

• ochrona organizmy przed bakteriami z przewodu pokarmowego

• żeby rozróżnić co szkodliwe to jelita mają mechanizm zbierający próbki i analizujący zawartość pokarmu:

• wyspecjalizowane komórki nabłonkowe – kępki Peyera (kom. M – pobierają obce cząsteczki i przekazują kom. prezentującym antygen; kom. prezentujące antygen i limfocyty T)

1. oskrzeli (BALT) – są to obszary, w których następuje kontakt komórek układu odpornościowego z tym co jemy i wdychamy (50% masy układu odpornościowego)

1. Antygeny różnicowania (markery CD)

Wprowadzenie przeciwciał monoklonalnych swoistych dla jednej determinanty antygenowej pozwoliło ustalić, że pewne grupy przeciwciał rozpoznają ten sam antygen różnicowania. Dla określenia antygenu definiowanego przez grupę przeciwciał monoklonalnych przyjęto skrót CD (antygen różnicowania) w połączeniu z przyznanym numerem, według kolejności odkrycia.

1. Cząsteczki wiążące antygen

1. Immunoglobuliny = przeciwciała, występujące w postaci wolnej lub związane na powierzchni limfocytów B (BCR), Grupa białek surowicy powstających pod wpływem działania immunogenu i mających zdolność do swoistego łączenia z nim

• są molekułami efektorowymi odporności humoralnej

• ich synteza zachodzi w limfocytach B i komórkach plazmatycznych

• spotyka się zarówno immunoglobuliny wolne jak i wbudowane w błonę limfocytów B, stanowiące ich receptory

• aglutyniny – zlepiają bakterie

• precypityny – zlepiają białka rozpuszczalne

• cytotoksyny – uszkadzają komórki

• opsoniny – ułatwiają fagocytozę

Jeden rodzaj przeciwciała może w zależności od warunków i charakteru antygenów precypitować go, aglutynować lub uszkadzać cytotoksycznie, Ponadto każda z tych frakcji może być wykonywana przez przeciwciała należące do różnych klas

• Budowa

Niezależnie od funkcji mają podobną budowę i identyczny mechanizm reagowania z antygenem:

• 2 łańcuchy lekkie – określają typ immunoglobuliny, zbudowane z 211 aminokwasów:

• typ I – łańcuch kappa

• typ II – łańcuch lambda, które dzielą się jeszcze na cztery podtypy

Oba typy łańcuchów występują we wszystkich klasach Ig

• 2 łańcuchy ciężkie: α, β, ϒ, δ, ɛ - określa przynależność immunoglobuliny do określonej klasy. Zbudowane z około 440 aminokwasów. W ich obrębie występują podklasy różniące się w zakresie części stałej:

• 4 podklasy w obrębie łańcucha ϒ (ϒ₁-ϒ₄)

• 2 podklasy łańcucha α

• podstawową jednostką Ig jest tetramer składający się z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich tej samej klasy oraz dwóch identycznych łańcuchów lekkich tego samego typu powiązanych wiązaniami disiarczkowymi

• tetramer jest dwuwartościowy – może połączyć się z dwiema identycznymi determinantami antygenu

• fragment Fab – składa się z części łańcucha ciężkiego i całego łańcucha lekkiego, łączy się z antygenem, nie powoduje jednak aglutynacji, ani precypitacji gdyż jest jednowartościowy – nie ma funkcji biologicznych czym różni się od fragmentu Fc

• enzymy papaina i pepsyna – rozszczepiają cząsteczkę immunoglobuliny po jednej lub drugiej stronie wiązań dwusiarczkowych łączących łańcuchy ciężkie. Po wpływem papainy cząsteczka ulega rozdzieleniu na trzy prawie równej wielkości fragmenty – dwa z nich nazywa Fab, jeden Fc

• w obrębie łańcuchów H i L wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe tworzą pętle zwane domenami (łańcuchy lekkie 2, a ciężkie 4). Każda domena warunkuje co najmniej jedną funkcję biologiczną przeciwciała

• Domeny V_L i V_H – tworzą miejsce wiązania determinanty antygenowej

• C_H1 i C_L stabilizują to miejsce

• C_H2 i C_H3 znajdują się w obrębie Fc – odpowiedzialne za wiązanie dopełniacza i kontrolę katabolizmu cząsteczki Ig oraz za przyłączanie przeciwciała do powierzchni komórek (cytofilność)

• region zasadowy – występuje w łańcuchach ciężkich w obrębie wiązania dwusiarczkowego. region ten łatwo ulega odkształceniom przestrzennym co sprawia, że fragmenty Fab w cząsteczce mogą się rozchylać pod kątem bliskim 180^o

• Rola fragmentu Fab – regiony zmienne (V) w obrębie łańcuchów lekkich i ciężkich, odpowiedzialne za związanie antygenu (końce procy) – antydeterminanty przeciwciał. Mają one zarówno łańcuchy ciężkie jak i lekkie. Pozostała część nosi nazwę fragmentów stałych

• regiony nadzmienne – hiperzmienne – strefy Fab charakterystyczne dla jedynie danej immunoglobuliny, które mają bardzo dużą zmienność

• Rola fragmentu Fc

• warunkuje cechy biologiczne

• odgrywa ważną rolę w procesie wiązania i aktywacji dopełniacza oraz podczas fagocytozy

• klasy immunoglobulin:

• monomery – wszystkie, ale IgA i IgM też może być w krążeniu

• dimery – IgA na powierzchni błon śluzowych

• polimery – IgM (pentamer) – zwierają dodatkowy łańcuch je łączący J

• IgA

• produkcja 10 g na dobę

• w osoczu jest monomerem

• głównie w postaci wydzielniczej:

  • fr. J łączący i fr. wydzielniczy (sekrecyjny) β globulina

  • pot, łzy, wydzieliny gruczołów

  • dwie podklasy IgA₁ i IgA₂

  • pierwsza linia obrony przeciw mikroorganizmom występującym w błonach śluzowych

• IgD

• obok IgM na limfocytach B dziewiczych jako receptor immunoglobulinowy (te które nie były jeszcze pobudzane przez antygen)

• bardzo niskie stężenie w płynach ustrojowych

• IgE

• reakcje nadwrażliwości

• obrona przed zakażeniami pasożytniczymi

• występują głównie na powierzchni komórek tucznych powodując uwolnienie ziaren z tych komórek

• IgM

• wytwarzane jako pierwsze w przebiegu odpowiedzi immunologicznej

• małe powinowactwo do antygenu

• 10 miejsc wiążących antygen zapewnia dużą skuteczność w wiązaniu antygenów bakteryjnych

• występuje w postaci receptora dla antygenów na limf B

• w krwi pentamer

• zalicza się tu również przeciwciała syntetyzowane w prekurdorach limfocytów B

• IgG

• w surowicy największe stężenie

• 4 podklasy

• zdolność aktywacji dopełniacza na drodze klasycznej (obok IgM)

• zdolność migracji przez łożysko

• opsonina

• Rola przeciwciał w odpowiedzi immunologicznej

• mogą aktywować dopełniacz na drodze klasycznej

• opsonizacja – mogą pokrywać bakterię i wiązać się z nią, a fagocyty mają zdolność wiązania fragmentu Fc tych związanych przeciwciał

• determinują mechanizm zabijania – cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (komórki nowotworowe, przeszczep – komórki K mające receptory dla antygenów

• udział w reakcjach nadwrażliwości - IgE

	IgG	IgA	IgM	IgD	IgE
Stężenie w surowicy	8-16 mg/ml	1,4-4 mg/ml	0,4-2 mg/ml	0,03 mg/ml	Ng/ml
Masa cząsteczkowa	150	170-420	900	180	190
Aktywacja C	+	-	++++	-	-
Nadwrażliwość	-	-	-	-	++++
Przechodzenie przez łożysko	+	-	-	-	-

1. Receptor komórek B, BCR – jest receptorem limfocytów B (IgM i IgD) odpowiadającym za wiązanie antygenów przez te komórki.

• Składa się z umieszczonego w błonie komórkowej przeciwciała oraz dwóch dodatkowych łańcuchów polipeptydowych: Igα i Igβ (odpowiednio: CD79a i CD79b).

• Przeciwciało umieszczone w błonie komórkowej różni się od przeciwciała wydzielanego tym, że posiada dodatkową domenę transbłonową oraz wewnątrzkomórkową, natomiast jego swoistość i powinowactwo do antygenu jest takie samo, jak w przypadku przeciwciał wydzielanych przez dany klon limfocytów.

• Klasa przeciwciała umieszczonego w błonie jest taka sama, jaką będą miały przeciwciała wydzielane przez limfocyt, dlatego na podstawie BCR można mówić o np. o limfocytach B IgM+ (czyli takich, które wydzielają przeciwciała IgM, występujące także w postaci BCR na ich powierzchni).

• Łańcuchy Igα i Igβ pełnią funkcję białek przekazujących sygnał do wnętrza komórki. Nie wiążą się one bezpośrednio z antygenem, lecz odbierają zmiany konformacyjne przeciwciała błonowego i pobudzają kinazy odpowiedzialne za przekazywanie sygnału. Ich rola jest więc podobna do roli CD3 w kompleksie z TCR.

1. przeciwciała monoklonalne - zbiór przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są otrzymywane z jednego klonu limfocytów B.

• występują przy szpiczaku – komórki nowotworowe zdolne do produkcji tych przeciwciał (zmienione komórki plazmatyczne), które zawierają tylko łańcuchy kappa albo tylko lambda

• stały się podstawowym narzędziem immunoterapii nowotworowej

• służą do identyfikowania poszczególnych komórek układu krwionośnego

• posiadają bardzo wysoką swoistość epitopową – powstała na skutek odpowiedzi na jeden konkretny epitop:

• PM chimeryczne – część zmienna pochodzi od myszy, a stała od człowieka, 77% sekwencji ludzkich

• PM humanizowane – regiony hiperzmienne pochodzą od myszy, reszta od człowieka (95% sekwencji) – najwięcej leków

• PM ludzkie – zawierzęta transegniczne

• produkcja:

1. uczulenie zwierzęcia

2. wycięcie śledziony i wypreparowanie limfocytów

3. komórki śledzionowe poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka

4. tworzy się hybryda, która skupia cechy obu tych komórek (nieśmiertelność, przeciwciało monoklonalne)

5. nie wszystkie fuzjują, inne giną po podaniu hipoksantyny, pozostają tylko hybrydy

6. leki: herceptyna (rak piersi), ritux (leczenie białaczek), rylotarg

1. TCR

• należy do nadrodziny immunoglobulin

• wykazuje większą heterogenność niż przeciwciała

• jest transmembranowym heterodimerem

• ściśle współpracuje z cząsteczką CD3 (odpowiada za proces transdukcji sygnału) – cząsteczka CD3 zbudowana jest z kilku łańcuchów, w których występują sekwencje itta w końcu zetta (w procesie transdukcji sygnału mają kluczowe znaczenie – reszty tyrozynowe ulegają fosforylacji co zapoczątkowuje transdukcję)

• typ I – składa się z dwóch łańcuchów α i β połączonych mostkiem dwusiarczkowym

• typ II – występuje na małej subpopulacji człowieka i zbudowany jest z łańcuchów λ i δ

• miejsce wiązania antygenu jest utworzone przez łańcuchy alfa i beta lub gamma i delta

• łańcuchy te mają dwie domeny – w pierwszej z nich – V znajdują się trzy regiony nadzmienne (odcinek N-koncowy), druga ma charakter stały (odcinek C-koncowy), Obie są glikozylowane

• odcinek stały zakończony jest polipeptydem transmembranowym, który zakotwicza domeny w błonie komórkowej

• łańcuchy wykazują pod względem struktury przestrzennej znaczne podobieństwo do fragmentu Fab i podobnie jak one są jednowartościowe

1. MHC HLA – białka powierzchniowe, które warunkują rozpoznanie komórek układu immunologicznego między sobą, a więc warunkuje kluczową rolę w jego działaniu i regulacji. Odpowiada za proces prezentacji antygeny – limfocyt T musi mieć antygen pokazany, inaczej go nie widzi (główny kompleks zgodności tkankowej)

Funkcja:

• prezentacja antygenu, zdeterminowana strukturą cząsteczek klasy I i II

• każdy z nas ma przez całe życie określone antygeny HLA klasy I i II

• antygeny klasy I i II mimo odmienności budowy wykazują podobieństwo: składają się z polimorficznego N-końcowego odcinka, który wiąże immunogenne polipeptydy oraz niepolimorficznego odcinka zbliżonego budową do domeny C immunoglobulin oraz odcinka transmembranowego i C-końcowego odcinka cytoplazmatycznego

• budowa HLA klasy I (HLA-A, HLA-B i HLA-C):

• łańcuch ciężki – α₁ i α₂ (4 pasma beta i jedna alfa helisa), a pomiędzy nimi rowek, w którym kotwiczy się peptyd mający ulec prezentacji oraz α_3.

• łańcuch lekki – β₂ mikroglobulina, związany niekowalencyjnie z alfa – reguluję ekspresje antygenów MHC klasy I

• ma część cytoplazmatyczną i przedbłonową

• domeny alfa jeden i dwa są bardzo zmienne, polimorficzne, aby istniała możliwość zaprezentowania możliwie dużej ilości antygenów. Im większy polimorfizm HLA tym większa zdolność populacji do obrony przed czynnikami szkodliwymi, ale ciężko znaleźć dawcę narządu

• budowa HLA klasy II (HLA-D)

• heterodimer zbudowany z dwóch zakotwiczonych w błonie komórkowej łańcuchów polipeptydowych, połączonych niekowalencyjnie:

• łańcuch α₁ lub α₂ – również tworzą rowek

• łańcuch β₁ i β₂

Domeny alfa jeden i beta jeden obu łańcuchów wykazują znaczną zmienność sekwencji (polimorfizm) i tworzą jednolitą strukturę przestrzenną 4+4 pasm beta i 2 helisy alfa. Struktura ta jest otwarta na obu końcach i może wiązać peptydy

Alfa dwa i Beta dwa stanowi część stała podobną do sekwencji C immunoglobulin

WYKŁAD 2

1. Antygeny komórkowe – antygeny różnicowania – markery CD, występują w błonie komórkowej i na terenie komórek:

• Wśród całego zestawu powierzchniowych cząsteczek komórek układu odpornościowego znajdują się mniej lub bardziej charakterystyczne dla danej komórki: niekiedy występują na powierzchni wszystkich limfocytów (CD2, CD3), inne charakteryzują tylko konkretne typy komórek (limfocyty T, B, monocyty, komórki NK). Reprezentatywne cząsteczki błonowe nazywa się markerami.

• Odpowiednia konfiguracja cząsteczek CD na powierzchni komórek układu odpornościowego jest niezbędna do ich dojrzewania i różnicowania oraz do pełnienia funkcji i współdziałania z innymi komórkami

• Podstawą identyfikacji typu komórki i zróżnicowania subpopulacji/określenia stanu aktywacji jest analiza ekspresji zestawu markerów komórkowych na podstawie immunoreakcji z odpowiednim specyficznym przeciwciałem monoklonalnym.

• Ekspresja markerów może się zmieniać w zależności od stanu czynnościowego komórki i etapu jej różnicowania. Wpływ na ekspresję cząstek powierzchniowych mają substancje immunogenne, specyficzne przeciwciała, cytokiny.

1. Limfocyty B

• ich podstawowym zadaniem jest produkcja przeciwciał, co zachodzi po stymulacji antygenem i przekształceniu limfocytów B w komórki plazmatyczne

• komórki B cechuje możliwość przełączania klas syntetyzowanych przeciwciał z IgM, powstałych podczas odpowiedzi pierwotnej, na pozostałe izotypy podczas odpowiedzi wtórnej, zazwyczaj podczas sekwencji IgGIgAIgE

• komórki B charakteryzują się obecnością receptorów immunoglobulinowych BCR, rozpoznających swoiście antygen oraz receptorów dla fragmentu Fc immunoglobuliny (FcR) i dla dopełniacza (CR)

• receptory BCR mają strukturę immunoglobuliny IgM i IgD oraz są połączone niekowalencyjnie z białkami Igαn (CD79a) i Igβ (CD79b)

• odmienna ekspresja cząsteczek (IgD, CD5, CD11b/CD18, CD23, CD45) na komórkach B pozwala na rozróżnienie swóch subpopulacji limfocytów obwodowych – B1 i B2.

• B2- konwencjonalnie komórki B, wysoki poziom ekspresji IgM i IgD; obecne głównie w krwi, mają krótki czas przeżywania

• B1 – cechują się eskpresją CD45 i prawie nie mają CD23 i mają CD5⁺!! co jest podstawową różnicą między nimi dwoma!; nie ma ich we krwi, są na obwodzie

1. Limfocyty T

• ich rozwój w grasicy prowadzi do powstania heterogennej grupy komórek o różnych funkcjach, które jako dojrzałe komórki efektywnie biorą udział w odporności przeciwko różnym czynnikom

• aby osiągnąć dojrzały funkcjonalny stan rozwoju, w komórkach T musi dojść do rearanżacji genów, które kodują heterodimeryczny TCR (αβ lub ϒδ), komórki te muszą przetrwać selekcję w grasicy

• jako pierwsze powstają w grasicy limfocyty T_ϒδ, które opuszczają grasicę i zasiedlają tkanki obwodowe

• wraz z rozwojem komórek T obserwuje się różnice w ekspresji łańcuchów α i β receptora rozpoznającego antygen (TCR) oraz cząsteczek CD4 i CD8

• rozwój tymocytów przebiega poprzez stadia zmiennej koekspresji z antygenami CD25 (łańcuch α receptora IL-2) oraz CD44 (receptor zasiedlania, dla hialuronianu), które pojawiają się i znikają z powierzchni tymocytów regulując ekspresję CD4 i CD8

• niedojrzałe tymocyty nie mają wcale CD4 i CD8 – są podwójnie ujemne, ale mają łańcuch β receptora TCR

• w miarę dojrzewania stają się podwójnie dodatnie i mają CD4⁺ CD8⁺ oraz pojawia się łańcuch α receptora TCR

• tymocyty wyselekcjonowane przez antygeny MHC klasy I mają fenotyp: CD4^- CD8⁺

• tymocyty wyselekcjonowane przez antygeny MHC klasy II mają fenotyp: CD4⁺ CD8^-

• dojrzałe kompetentne limfocyty T tworzą odpowiednio populacje limfocytów Th (CD4⁺) i cytotoksycznych (CD8⁺), obie populacje mają receptor TCR i cząsteczkę CD25

• ponad 90% limfocytów krwi obwodowej ma receptory TCRαβ. Komórki Th (najczęściej CD4⁺) wytwarzają substancje które aktywują inne komórki i w ten sposób kierują odpowiedzią immunologiczną. Różnią się one wydzielanymi cytokinami

• Th1 – odpowiedzialne za skierowanie odpowiedzi w kierunku komórkowej: IL-2, TNF, IFN-ϒ

• Th2 – stymuluje odpowiedź humoralną: IL-4, IL-5, IL-10

• Th3 – wydzielają jeden z najpotężniejszych czynników immunosupresyjnych – TGF-β

• komórki cytotoksyczne Tc to głównie komórki o fenotypie CD8⁺ - niszczą one bezpośrednio inne komórki lub pasożyty

• limfocyty Treg są CD4⁺ CD25⁺ i wydzielają IL-10 oraz TGF-β więc mogą zwrotnie regulować aktywność tych limfocytów, które reagowały z antygenem inicjującym pobudzenie

1. komórki NK – duże, ziarniste, ruchliwe

• efekt ich działania nie podlega restrykcji MHC

• czynnikami wzrostu dla tych komórek są IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 i IL-21

• są bogate w cząsteczki CD56⁺ i receptory dla fragmentu Fc przeciwciał IgG (CD16⁺), warunkujące efekt cytotoksyczny za pośrednictwem przeciwciał (ADCC)

• komórki, które mają CD56⁺, ale mają mniej CD16 wykazują mniejszą cytotoksyczność

• oprócz podstawowego zestawu markerów posiadają również cząsteczki ułatwiające im migrację (LFA-1, Mac-1, VLA-4, CD31) oraz receptory hamujące i aktywujące zabijanie

1. komórki NKT – są oddzielną populacją komórek T.

• charakteryzują się one cechami komórek T (większość ma receptor TCRαβ i są CD3⁺ i CD4^- CD⁺, a tylko część CD4⁺)

• komórki te wykazują też obecność receptorów KIR charakterystycznych dla komórek NK

• rozpoznają one glikolipidy prezentowane im przez cząsteczki CD1

• stymulowane wydzielają IL-4, IFN-ϒ (aktywuje inne komórki do cytotoksyczności), IL-13, chemokinę i limfotoksyny

• mają zdolność do zabijania komórek nowotworowych

• ich ważną funkcją jest immunoregulacja, a zaburzenia prowadzą do autoimmunizacji

1. komórki pamięci

• są charakterystyczne dla odpowiedzi immunologicznej wtórnej

• cechuje je znacznie dłuższy okres przeżycia niż zwykłych limfocytów efektorowych

• wykazują zdolność do przenikania przez tkankę łączną i narządy nielimfatyczne

• zachowują informacje o strukturze antygenu obcego dla gospodarza i łatwiej ulegają aktywacji

• receptory BCR i TCR komórek pamięci charakteryzują się większym powinowactwem do antygenu niż komórki wcześniej nie stymulowane

• skrócenie czasu reakcji na dany antygen i wzrost swoistości odpowiedzi immunologicznej

Typ komórki	Występowanie	Antygeny powierzchniowe
Monocyty	Krew	MHC klasy II, CD14, CD35, CD64 (FcR)
Makrofagi	Tkanki	MHC klasy II, CD35, CD64
Komórki dendrytyczne	Krew i tkanki	CD83, CD80, CD86
Granulocyty	Krew i tkanki	CD11, CD16, CD18, CD35, C5aR
Neutrofile	Krew i tkanki	CD32 (FcϒRII)
Eozynofile	Krew i tkanki	CD32, CD23
Bazofile	Krew i tkanki	FcϒRI
Komórki tuczne	Tkanki	FcϒRI
Limfocyty T Wszystkie subpopulacje Th Tc	Grasica, śledziona, węzły, krew	CD2, CD3, CD5, CD7, CD28 TCR CD4 CD8
Limfocyty B	Szpik, śledziona, węzły, MALT, krew	CD19, CD20, CD40, BCR (sIgM, sIgD), MHC klasy II (HLA-DR), CD79, CD22, CD32, CD35
Komórki NK	Śledziona, węzły, tkanki śluzowe, krew	CD2, CD11b, CD16, CD56, brak receptorów dla antygenu, CD3^-

Wszystkie leukocyty mają CD45

1. Normy subpopulacji leukocytów w krwi obwodowej

Leukocyty		5,9 tys/1mm^3
Limfocyty	30%	28-39
T	70%	67-76
B	13%	11-16
NK	14%	10-19
TCD4^+	42%	38-46
TCD8^+	35%	31-40
CD4/CD8 (stosunek cytotoksycznych do prawidłowych)	1,2%	1-1,5

1. Źródła badań diagnostycznych:

krew, szpik, płyn z węzłów pobrane na wymaz, w związku z czym musimy wyeliminować skrzep za pomocą substancji:

• wersenian sodu

• cytrynian sodu

• heparyna

1. Ocena immunofenotypowa komórek

• immunofenotyp – zestaw antygenów powierzczchniowych i cytoplazmatycznych charakterystyczny dla danej subpopulacji leukocytów

• metoda immunofluorescencji bezpośredniej – technika wykrywania antygenów z użycie przeciwciał swoistych dla tych antygenów i znakowanych fluorochromami stosowanymi w cytometrii (np. FITC, PE, PerCP, APC)

• metoda immunofluorescencji pośredniej – złożona z dwóch etapów technika wykrywania antygenów z użyciem dwóch przeciwciał:

1. etap pierwszego przeciwciała – swoistego wobec oznaczanego antygenu i o znanym izotypie (np. IgG1, IgG2, IgM)

2. etap drugiego przeciwciała – skierowanego przeciwko wykorzystanym w pierwszym etapie przeciwciałom określonego typu i połączonego z odpowiednimi fluorochromami

1. wykorzystanie cytometrii przepływowej:

• ocena immunofenotypu komórek biorących udział w odpowiedzi odpornościowej lub pojawiających się w stanach rozrostowych układu limfo i mieloidalnego

• ocena funkcjonalnych cech komórek układu np. zdolność do fagocytozy, wytwarzani cytokin, proliferacji, apoptozy, przebiegu cyklu komórkowego

Przebieg:

1. reakcja fluorescencji pośredniej lub bezpośredniej – do wykrywania określonych antygenów komórek poddawanych immunofenotypowaniu wykorzystuje się swoiste dla nich przeciwciała koniugowane ze znacznikami (PE – fikoerytryna, zielony; FITC – fluoresceina, czerwony) flurescencyjnymi. Metody te pozwalają na wykazanie obecności jednego lub kilku antygenów jednocześnie

Przeciwciała znakowane fluorochromem – są wzbudzane światłem o odpowiedniej długości fali na skutek czego komórki zaczynają świecić. Ze względu na mnogość obecności antygenów CD3 komórki świecą jak obręcze. Następnie trzeba je zliczyć

1. cytometria przepływowa – temu badaniu można poddać każdy rodzaj komórek pozostający w zawiesinie. Cytometr przepływowy nazywany jest FACS co oznacza sortowanie komórek znakowanych fluorescencyjnie

• budowa cytometru:

• przepływ cieczy

• moduł optyczny

• moduł elektroniczny

W badaniu cytometrycznym komórki są oceniane pojedynczo, a jest to możliwe dzięki obeności modułu przepływu cieczy

Przebieg:

• przygotowany materiał (krew z przeciwciałam naznaczonymi fluorochromem, zinkubowana, odrzucone przeciwciała niezwiązane) pobierany jest do komory przepływu, w której dzięki zjawisku ogniskowania hydrodynamicznego komórki ustawiają się w centrum strumiania płynąc jedna za drugą

• w module optycznym następuje emisja i detekcja światła (laser argonowy lub dioda):

strumień przepływających komórek jest prostopadły do przebiegu promieni lasera. Światło padając na komórkę ulega rozproszeniu, a związane z komórką cząsteczki fluorochromu emitują fotony światła o długości fali charakterystycznej dla użytego znacznika. Mamdy dwa parametry:

• światło rozproszone bocznie SSC – określa ziarnistość komórki, detektor ustawiony pod kątem 90^o

• światło rozproszone przednio FSC – określa wielkość komórki oraz strukturę błony komórkowej. Im większe tym większa, światło rozpraszane pod kątem 10^o

• światło emitowane przez wzbudzone fluorochromy – dociera do detektorów i jest wzmacniana i zamieniana na sygnały elektryczne, których napięcie jest mierzone i przetwarzane cyfrowo w module elektronicznym

• uzyskana wartość napięcia określana jest mianem średniej intensywności świecenia lub fluorescencji i jest ona proporcjonalna do ilości wykrywanego antygenu

• każda komórka głównie ze względu na obecność aminokwasów aromatycznych, emituje pod wpływem światła lasera niewielką, lecz wykrywalną przez cytometr liczbę fotonów – autofluorescencja

• Komputerowy obraz przetworzony jest prezentowany w postaci histogramów, wykresów kropkowych i poziomicowych. Na podstawie zależności pomiędzy wartościami świecenia zebranymi z detektora FSC i SSC można wydzielić populacji leukocytów krwi obwodowej różniące się wielkością i ziarnistością komórek

1. Ocena czynnościowa komórek układu odpornościowego – zdolność do wykonywania określonych efektorowych funkcji

1. izolacja np. limfocytów z krwi obwodowej

Odbywa się za pomocą techniki gradientowej. Krew z dodatkiem antykoagulantna (heparyna, EDTA, cytrynian) wirujemy w gradiencie gęstości fikolu i uropoliny. Komórki tworzą opalizujący pierścień na granicy faz osocza i fikolu, reszta elementów morfotycznych krwi znajduje się w osadzie

1. test transformacji blastycznej – test odpowiedzi proliferacyjnej – standardowy test oceniający prawidłową aktywację limfocytów T, zanim ulegną one zróżnicowaniu w funkcjonalne komórki efektorowe. Ma on na celu pomiar proliferacji komórek hodowanych uprzednio w obecności różnych stymulatorów: mitogenów, superantygenów, specyficznych przeciwciał.

• poliklonalna bądź antygenowo specyficzna aktywacja komórek jest następstwem interakcji stymulatora z odpowiednim receptorem występującym na powierzchni komórki- najszersze zastosowanie znalazły stymulatory poliklonalne należące do mitogennych lektyn jak fitohemaglutynina PHA, ConA lub mitogen szkarłatki PMW

• optymalną odpowiedź proliferacyjną uzyskuje się po około 72 godzinach, jeśli używa się mitogenu i po 7-14 dniach jeśli stymulatorem jest swoisty antygen

• odpowiedź proliferacyjną mierzy się na podstawie inkorporacji tymidyny znakowanej trytem (³H-tymidyna) do nowo syntezowanych nici DNA (prekursor kwasów nukleinowych) – proces ten jest odzwierciedleniem zmian liczebności komórek hodowlanych

• po przeniesieniu komórek na filtry z włókna szklanego bądź krążki bibułowe mierzymy radioaktywność limfocytów w liczniku scyntylacyjnym i na tej zasadzie oceniamy zdolność do proliferacji

• wynik podaje się w cpm – określa ilość rozbłysków w czasie jednej minuty lub dpm – ilość rozpadów radioaktywnych w czasie 1 minuty

• indeks stymulacji: cpm hodowli stymulowanej/cpm hodowli niestymulowanej

1. test cytometryczny – izotopowy – polega na ocenie ekspresji markerów aktywacji:

• CD69

• HLA-DR

• CD25

• CD71

1. test cytotoksyczny – test izotopowy, ocena cytotoksyczności przez pomiar uwalniania ⁵¹Cr najczęściej limfocytów CD8⁺, ale też i NK

1. komórki docelowe, wskaźnikowe – komórki, które mają zostać zniszczone, czyli np. nowotworowe lub zarażone wirusem znakuje się izotopem chromu (Na₂[⁵¹Cr]O₄)

2. wyznakowane komórki po odpłukaniu wolnego Cr miesza się z populacją badanych komórek efektorowych i wspólnie hoduje przez 4-6 h

3. w tym czasie komórki efektorowe wykazują działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek wskaźnikowych

4. mierząc w hodowanym supernatancie ilość Cr uwolnionego z komórek wskaźnikowych, które uległy lizie, ocenia się aktywność cytotoksyczną komórek efektorowych

5. każdy test musi zwierać dwie opcje kontrolne, umożliwiające ocenę zarówno lizy spontanicznej, zachodzącej przy braku komórek efektorowych, jak i lizy całkowitej zachodzącej w obecności jakiegoś detergentu

• odsetek komórek które uległy lizie

%lizy = (E_Lcpm - S_Lcpm/M_Lcpm – S_Lcpm) x 100 lub cpmT-cpmS/cpmM-cpmS

E_Lcpm – średnia wartość cpm z dołków testowych

S_Lcpm – średnia wartość cpm z dołków niestymulowanych (liza spontaniczna)

M_Lcpm – z dołków zawierających Triton (liza maksymalna)

cpmT – czas rozpadu na minutę

cpmS – spontaniczne uwalnianie

cpmM – maksymalne uwalnianie

1. test komórek fagocytujących – zdolność komórek fagocytujących do fagocytozy lub zabijania komórek bakterii. Wykonywane na pełnej krwi, gdyż nie ma potrzeby izolowania fagocytów

Najczęściej ocenia się:

• zdolność do migracji

• zdolność do pochłaniania drobnoustrojów

• metabolizm tlenowy

• degranulację ziarnistości

  • fagotest – wykorzystuje cytometrię przepływową

1. do probówki wprowadzamy bakterię E. Coli, która znakowana jest fluoresceiną

2. inkubacja krwi, w czasie której następuje ewentualna fagocytoza

3. to czy komórki fagocytowały i na ile określamy za pomocą cytomtrii przepływowej, gdzie sprawdzamy jak nasze fagocyty (granulocyty, monocyty) intensywnie świecą

Wykładnik świecenia – pik przesuwający się na FL1, im dalej tym mocniej świecą

• fagoburst – mierzy wielkość wybuchu tlenowego (mechanizm zabijania bakterii z udziałem wolnych rodników tlenowych)

Jeżeli brak wolnych rodników to znaczy, że komórka nie ma zdolności zabijania

1. próbkę krwi + E. Coli, która tym razem nie jest znakowana łączymy z dihydrorodaminą (nie jest fluorochromem, ale pod wpływem wybuchu tlenowego zmienia się w rodaminę, która nim jest i widzimy fluorescencję)

   • test pochłaniania i redukcji NBT – błękit nitrotetrazoliowy

1. inkubujemy granulocyty z endotoksyną

2. następnie dodajemy NBT i znów inkubujemy

3. następuje reedukacja NBT na skutek czego widzimy zmianę barwy

4. oceniany zmianę reakcji barwnej mikroskopowo lub spektrofotometrycznie

WYKŁAD 4

1. Cechy odpowiedzi nieswoistej

• jest wrodzona

• biorą w niej udział komórki fagocytujące (makrofagi, granulocyty) oraz komórki NK

• w jej wyniku nie powstają komórki pamięci immunologicznej

• jest odpowiedzią natychmiastową w przeciwieństwie do odpowiedzi swoistej

• elementem odpowiedzi nieswoistej jest też np. skóra, błony śluzowe i ich powierzchnia (śluz, komórki rzęskowe)

• w odpowiedzi nieswoistej bardzo ważną rolę pełni układ dopełniacza!

1. Układ dopełniacza

• określa się go literą C

• składa się z około 35 białek powstających w wątrobie, a jego podstawową funkcją jest zabijanie bakterii i zakażonych komórek jądrzastych

• 35 białek = składowe układu dopełniacza, w tym kilka inhibitorów oraz będących składowymi błon komórkowych

  • Funkcje:

• niektóre są opsoninami – posiadają zdolność opłaszczania bakterii - C₃ i C_{4 co} ułatwia fagocytozę

• czynniki chemotaktyczne – zwołują komórki odpowiedzi nieswoistej do miejsca zapalenia

• dodatkową funkcją jest ułatwienie usuwania kompleksu immunologicznego przez komórki żerne

• białka stanowią istotny składnik odpowiedzi naturalnej, a także w fazie efektorowej odpowiedzi humoralnej;

• uczestniczą w przeciwinfekcyjnej obronie organizmu na drodze bezpośredniego zabijania lub lizy drobnoustrojów oraz zjawiskach zapalnych poprzez generację polipeptydów o aktywności prozapalnej

  • budowa – wyżej wymienione aktywności związane są szeregiem interakcji o charakterze enzymatycznym między poszczególnymi składnikami układu dopełniacza – ich skutkiem jest ograniczona proteoliza niektórych z biorących udział w tych reakcjach cząsteczek – skutkuje ona rozkładem substratu na dwa fragmenty:

1. większy łączy się z poprzednio aktywowanymi składnikami, tworząc nową aktywność enzymatyczną, zdolną do działania na następny czynnik kaskady (określane literką b)

2. mniejszy ma często bardzo silnie wyrażone działanie prozapalne (określane literką a)

   • składniki dopełniacza otrzymywały numery w kolejności odkrycia, także numer nie oznacza danego miejsca w kaskadzie działania: C1, C4, C2, C3, C5 do C9

   • układ dopełniacza składający się z kolejnych enzymów i substratów wykazuje pewną swoistość biochemiczną, chociaż niektóre enzymy kaskady mogą być niekiedy zastąpione przez inne enzymy proteolityczne

   • reakcję kaskady można podzielić na dwie fazy:

1. faza aktywacji

2. faza ataku

Cały ten proces zapoczątkowany jest swoiście przez reakcję antygen-przeciwciało (droga klasyczna) lub nieswoiście (droga alternatywna i lektynowa) przez bezpośrednie interakcje z powierzchnią drobnoustrojów. Obie drogi mają wspólny przebieg aktywacji, począwszy od grającego wspólną rolę fragmentu C3, a ich poszczególne składniki wykazują homologię strukturalną

1. Nazewnictwo składowych dopełniacza:

• C1q

• C4b i C2a = C4b2a

• C1s z kreską do góry to aktywowana postać składowej

• C5b-8 – oznacza kompleks zawierający składniki C5b, C6, C7 i C8

1. Aktywacja dopełniacza:

Niezależnie od drogi aktywacji zawsze dochodzi do powstania dwóch istotnych enzymów: konwertazy C3 i C5, a kończy się na powstaniu kompleksu atakującego błonę MAC (jest strukturą białkową powstającą w końcowym etapie aktywacji dopełniacza. Uczestniczy w jednym z ważnych mechanizmów nieswoistej odpowiedzi immunologicznej. W wyniku jego działania dochodzi do lizy (śmierci) komórki)

Celem aktywacji dopełniacza jest zniszczenie bakterii wskutek perforacji błony komórkowej bakterii

1. droga klasyczna – wymaga obecności przeciwciał powstających w wyniku odporności swoistej (zapoczątkowanie aktywacji)

1. przeciwciało bakterii (jego fragment Fc) łączy się z antygenem przeciwbakteryjnym tworząc kompleks, który uzyskuje zdolność wiązania komponentu C1, co prowadzi do sekwencyjnego włączania się dalszych składników.

2. pierwszy składnik drogi klasycznej złożony jest z trzech oddzielnych białek:

• pojedyncza cząsteczka C1q – należy do białek kolektyn (posiadają cukry wiążące część lektynową)

• tetramer zawierający po dwie cząsteczki C1r i C1s, które tworzą kompleks w obecności jonu wapniowego

1. następuje związanie niekowalencyjne fragmentu Fc klasy IgM lub IgG z C1q co prowadzi do aktywacji C1s i C1r

2. kompleks C1 jest esterazą serynową, która aktywuje z kolei wiele cząsteczek C4 i C2 (amplifikacja)

3. aktywowana postać C1s rozkłada białka C4 i C2 w wyniku czego powstają fragmenty C4a i C4b (ten ma zdolność łączenia się z błoną komórkową, a C4a jest uwalniany do środowiska i pełni rolę anafilatoksyny)

4. po przyłączeniu się fragmentu C4b do błony następuje przyłączenie do niej podjednostki C2, która rozpada się na C2a (zostaje w środowisku jako anafilatoksyna) i C2b (łączy się z C4b i powstaje z niej konwertaza C3 drogi klasycznej)

5. konwertaza aktywuje jednostkę C3 poprzez C2b

6. powstaje czynnik C3a i C3b (przyłącza się do ściany komórkowej patogenu i funkcjonuje jako opsonina – reaguje na powierzchni komórki z receptorem dla C’ lub przyłącza się do konwertazy C3 i wytwarza kolejny enzym – konwertazę C5)

7. ten rozkłada się do C5a i C5b (bierze udział w tworzeniu kompleksu atakującego błonę) – jest to ostatni etap kaskady

8. z kolei aktywowany C5b reaguje z C6 i C7 tworząc trójcząsteczkowy kompleks C567 wiążacy się i wnikający do błony komórkowej poprzez interakcje hydrofobowe, co nazwano FAZĄ ATAKU (MAC)

• C567 może przyłączać się do komórek posiadających na powierzchni związane przeciwciała i fragmenty wcześniejsze dopełniacza

• lub też pozostają w środowisku i wtedy reagują z komórkami nieuczulonymi, powodując ich uszkodzenie

• Wywiera on również działanie chemotaktyczne na neutrofile

• współdziała w tworzeniu procesu zapalnego

• związany z błoną komórkową przyłącza C8, w następstwie powstaje C9, który ulega enzymatycznemu włączeniu do błony komórkowej i wytwarza tunel, przez który następuje wymiana osmotyczna między wnętrzem komórki a otoczeniem (Na⁺ i K⁺) co skutkuje lizą komórki

1. droga lektynowa

• zjawisko stare, u pierwotnych organizmów

• różni się od drogi klasycznej tym, że nie ma w niej przeciwciała. Są one zastępowane kolektynami np. lektyna wiąząca mannozę w osoczu – główny czynnik zapoczątkowujący drogę lektynową, ma strukturę podobną do przeciwciała

• mannoza aktywuje nie C1q, ale aktywuje inne proteazy co prowadzi do aktywacji C1r, reszta jest taka sama

• WNIOSEK: klasyczna droga aktywacji może być również zapoczątkowana, niezależnie od kompleksu antygen-przeciwciało, przez wydzielnicze PRR (receptory rozpoznające wzorce), z których wiele jest białkami ostrej fazy. Zaliczamy do nich:

• białko wiążące mannozę MBP

• białka surfaktantu A i D z rodziny kolektyn

• białko C-reaktywne wiązące fosforylocholinę

• polianiony np. DNA, heparyna

1. droga alternatywna – nie zależy od białek wiążących się z patogenami.

Jest istotnym składnikiem odporności naturalnej i ma większe znaczenie biologiczne niż droga klasyczna. Jej aktywacja może zostać zapoczątkowana przede wszystkim przez niektóre polisacharydy i lipopolisacharydy (endotoksyny bakteryjne), ale też przez agregowane Ig z wszystkich podklas IgG, IgA i IgE, przy czym miejsca aktywujące znajdują się we fragmentach Fab.

• w skład drogi klasycznej wchodzi szereg białek zbliżonych strukturalnie i funkcjonalnie do drogi klasycznej.

• jej aktywacja zachodzi w obecności jonów Mg²⁺ i jest kontynuacją stale utrzymującej się w ustroju niewielkiego stopnia samoistnej aktywacji składnika C3 i C3b, która ma miejsce na skutek reakcji z H₂O

1. reakcja rozpoczyna się od interakcji powstałego C3b z błoną komórkową bakterii

2. C3b wiąże czynnik B (proaktywator C3), przy czym ulega proteolizie przez czynnik D i jony Mg na Ba i Bb (odpowiada C1r i C1s drogi klasycznej)

3. uwolniony zostaje mały fragment Ba o działaniu chemotaktycznym, który zostaje uwolniony do środowiska

4. Bb wiąże się ze składową C3 H₂O

5. kompleks C3bBb będący alternatywną konwertazą C3 jest nietrwały, lecz stabilizuje go properdyna (P)

6. ten kompleks łączy się z błoną

7. kompleks C3bBb oraz łączący się z nim wytworzony dodatkowo, fragment C3b mają aktywność konwertazy C5 (C3bBb3b)

   • obie drogi aktywacji najczęściej ulegają wzajemnemu powiązaniu, gdyż C3b generowany na drodze klasycznej może uruchomić drogę alternatywną

   • z kolei aktywna konwertaza C3 (C3bBb) może być mechanizmem amplifikacyjnym dla drogi klasycznej, jako że ma identyczną funkcję co kompleks C4b2b (konwertaza C3) i aktywuje C3, tworząc C3b i C3a

Składnik dopełniacza	Funkcja
C1	Stabilizacja kompleksów immunologicznych
C2	Rozszerzenie naczyń i zwiększenie ich przepuszczalności przez kininę C2a
C3	C3a – anafilatoksyna, chemotaksja C3b – opsonizacja, aktywacja B
C4	C4a – anafilatoksyna C4b – neutralizacja wirusów
C5	C5a – anafilatoksyna i chemotaksja C5b, C6, C7 - cehmotaksja

1. Regulacja układu dopełniacza:

Układ dopełniacza ze względu na efekty uboczne uruchomienia kaskady znajduje się pod kontrolą kilku inhibitorów, obecnych w fazie płynnej i na powierzchni komórki. Ponieważ tworzenie konwertaz i wytwarzanie C3b to centralny punkt obu aktywacji, większość mechanizmów regulacyjnych jest skierowane właśnie na nie

Ponadto pośrednie komponenty kaskady mają krótki czas półtrwania, co minimalizuje ich uboczne działanie;

Inhibitory:

• inhibitor C1 esterazy (c1-INH) – wiąże się z C1r i C1s, blokując ich działanie proteolityczne

• c3/c5 konwertaza (C3b2b) – znajduje się pod kontrolą białka wiążącego C4 (C4bp) i związany z powerzchnią komórek DAF (czynnik przyspieszający katabolizm)

• karbonylaza N – inaktywator anafilatoksyny

• properdyna – stabilizuje układ dopełniacza

• syntezę regulują również hormony płciowe oraz cytokiny, szczególnie IFN-gamma, w mniejszym stopni IL-1 i IL-6

• ogólne stężenie składników dopełniacza jest określone genetycznie przez MHC

• są wytwarzane głownie przez hepatocyty, ale też makrofagi oraz limfocyty

• Czynniki osoczowe

• inhibitor C1 – hamuje aktywne proteazy C1r i C1s

• czynnik I – rozkłada C3b i C4b występujące w formie wolnej i związanej w konwertazach i powoduje rozpad konwertaz

• białko wiążące C4 – wiąże C4b i wspomaga czynnik I w hamowaniu konwertazy C3 drogi klasycznej

• czynnik H – wiąże C3b i wspomaga czynnik I w hamowaniu konwertazy C3 drogi alternatywnej

• białko S – blokuje C5b67 uniemożliwiając przyłączenie do błony komórkowej.

• Czynniki obecne na komórkach

• Czynniki obecne na komórkach są odpowiedzialne za wyłapywanie dopełniacza, zwłaszcza tych fragmentów, które powstają na skutek działania drogi alternatywnej. Umożliwia on obronę komórek własnego organizmu przed dopełniaczem aktywowanym spontanicznie. W gruncie rzeczy działanie drogi alternatywnej wynika tylko i wyłącznie z faktu, że drobnoustroje nie posiadają tego rodzaju czynników hamujących dopełniacz. Do czynników obecnych na komórkach należą:

• receptor dla dopełniacza (CR1) inaktywuje konwertazy przez rozkład C3b i C4b

• błonowy kofaktor białkowy (ang. Membrane Cofactor Protein, MCP, CD46) – wiąże C3b i C4b, obecny praktycznie na wszystkich komórkach jądrzastych organizmu

• czynnik przyspieszający rozkład (ang. Decay Accelerating Factor, DAF) – drastycznie skraca okres półtrwania konwertaz

• czynniki restrykcji homologicznej (ang. Homologous Restriction Factor, HRF, CD59) – wiążą C8 i C9, hamując tworzenie MAC

• MIRL (ang. Membrane Inhibitor of Reactive Lysis) – blokuje przyłączenie C9 i tworzenie MAC.

1. Znaczenie układu dopełniacza w stanach chorobowych:

• kłębuszkowe zapalenie nerek powstające na skutek aktywacji dopełniacza przez kompleksy immunologiczne odłożone w nerkach np. podczas infekcji HBV

• anafilatoksyny C3a, C4a i C5a mogą wywołać wstrząs

• obrzęk naczynioruchowy – niedobór inhibitora C1 (obrzęk Quinckego)

• choroba Alzheimera, udar mózgu

• hemoglobinuria

• jad, który działa poprzez aktywację dopełniacza

• nadwrażliwość typu III, co także jest związane z reakcją zapoczątkowaną przez kompleksy immunologiczne

• udział w niektórych chorobach autoimmunizacyjnych (np. toczeń układowy, reumatoidalne zapalenie stawów)

1. Rozpoznawanie drobnoustrojów przez nieswoiste mechanizmy odpornościowe:

   • wzorce molekularne związane z patogenami PAMP znajdujące się w błonie bakterii są rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzroce PRR

   • białko wiążące LPS – składnik ścian bakterii gram –; po związaniu z LPS pośredniczy w jego przekazaniu receptorom CD14 występującym na komórkach fagocytujących

   • kwas tejchojowy – gramm +

   • MBL - mannozy – składnik otoczek drożdży, pierwotniaków i wirusów. Aktywuje dopełniacz na drodze lektynowej oraz pełni rolę opsoniny, ponieważ po przyłączeniu do drobnoustrojów ułatwia fagocytozę poprzez interakcję z receptorem dla dopełniacza CR3

   • receptory rozpoznające wzroce PRR – alarmują o wystąpieniu zakażenia. Znajdują się zarówno na powierzchni komórek gospodarza, jak i we wnętrzu. Rozpoznawanie PAMPs przez te receptory skutkuje powstaniem czynnika jądrowego, co w konsekwencji uaktywnia szereg genów kodujących białka i peptydy o działaniu bakteriobójczym oraz cytokiny prozapalne(TNF-alfa, IL-1, IL-8, IL-12) i chemokiny:

• wydzielane: znajdują się opsoniny: kolektyny – białko wiążące mannozę, pentraksyny, przeciwciała, uwalniane do płynów tkankowych przez makrofagi i inne komórki. Są to produkty hepatocytów, znane jako białka ostrej fazy (lektyna, MBL, CRP), uczestniczą w aktywacji dopełniacza i opsonizacji drobnoustrojów, ułatwiając fagocytozę

• powierzchniowe (na makrofagach, neutrofilach, komórkach denrytycznych) – uczestniczą w fagocytozie, lektynowe zmiatacze, niektóre integryny, receptory Toll-podobne

• wewnątrzkomórkowe – niektóre receptory TLR – 3,7,8,9 oraz receptory NOD podobne i helikazy – powodują eskpresję genów związanych z mechanizmami odporności swoistej (antygeny zgodności tkankowej MHC I i II i inne)

• receptory TLR – Toll podobne

• wystepuje ich 10 rodzajów

• występują na powierzchni komórek oraz w ich wnętrzu, gdzie zakotwiczone są w błonie endosomów

• rozpoznają komponenty ściany komórkowej drobnoustrojów, a wewnątrzkomórkowe kwasów nukleinowych

• istnienie heterodimerów TLR zwiększa wachlarz rozpoznawanych PAMPs: kwas lipotejchojowy, zymosan

• Receptory NOD

• wydzielają chemokiny np. TNF-alfa i IL-6 biorące udział w rekrutacji i aktywacji komórek układu odpornościowego

• wydzielają cytokiny prozapalne (TNF-alfa, IL-6, IL-12)

1. Funkcje makrofagów i granulocytów w odpowiedzi immunologicznej

1. powstawania – b. duża, szczególnie w czasie infekcji; odbywa się w szpiku z komórek linii mieloidalnej powstają monocyty a następnie makrofagi

2. chemotaksja – przyciągają komórki żerne w miejsce zapalne. Najbardziej efektywnymi czynnikami chemotaktycznymi dla granulocytów są C5a i C3a oraz leukotrieny i chemokiny

mediatory zapalne aktywują śródbłonek naczyń krwionośnych w taki sposób, że fagocyty mogą przejść przez śródbłonek do miejsca zapalenia, aktywując mediatory chemotaksji o wzmożonych właściwościach cytotoksycznych

1. aktywacja –

• czynnik pochodzenia bakteryjnego aktywuje receptory rozpoznające wzorce

• cytokiny – interfeton gamma i interleukina 8

Zwiększają ekspresję genów odpowiedzialnych za funkcje cytotoksyczne komórek

1. Fagocytoza

• bakteria jest opsonizowana

• za pomocą receptorów tych opsonin następuje związanie z bakterią (MR, FcR, CR)

• następuje pochłonięcie bakterii formowanie fagosomu

• fuzja fagosomu z lizosomem zawierającym enzymy lizosomalne

• degradacja antygenów bakteryjnych do peptydów ulegających prezentacji. Natsępuje ich ubikwintyzacja i związanie z MHC II (w Aparacie Golgiego) [fagolizosom]

• wyrzucenie kompleksu na powierzchnię komórki i prezentacja limfocytom Th, które z kolei produkują cytokiny i stymulują limfocyty B do produkcji przeciwciał

1. Mechanizm zabijania drobnoustrojów przez komórki żerne

1. mechanizm tlenowy

• rodnik hydroksylowy i tlen singletowy

• H₂O₂

• MPO – mieloperoksydaza

• kwas podchlorawy

• tlenek azotu

1. mechanizm pozatlenowy:

• czynnik bakteriobójczy zwiększający przepuszczalność BPI

• jedno z najbardziej bakteriobójczych białek

• działa na bakterie gramm –

• nie działą na gramm + i grzyby

• wiąże się z bakterią i zwiększa przepuszczalność dla cząsteczek hydrofobowych i antybiotyków

• katepsyna G

• działa na gramm +, - i grzyby

• uwrażliwia bakterie na działanie lizozymem

• jest czynnikiem chemotaktycznym

• działa synergistycznie z elastazą

• defenzymy – lizosomalne białka kationowe

• antybiotyki peptydowe

• duża aktywność wobec wielu bakterii, grzybów i pasożytów

• działanie chemotaktyczne

• działanie przeciwnowotworowe

• przyspiesza gojenie się ran

• lizozym

• odkryty przez Fleminga

• najistotniejszy mechanizm odporności nieswoistej

• występuje w: łzach, ślinie, osoczu, wydzielinach dróg oddechowych

• degraduje ściany gramm - bakterii

WYKŁAD 5

MECHANIZM ODPORNOŚCI SWOISTEJ

1. Charakterystyka

• kształtuje się dłużej niż nieswoista, ponieważ muszą się wykształcić komórki efektorowe i nastąpić rozpoznanie antygenu

• mają wspólne drogi aktywacji dopełniacza

• biorą w niej udział limfocyty T i B

1. Dojrzewanie limfocytów:

• limfocyty B powstają i dojrzewają w szpiku

• limfocyty T na skutek czynników chemotaktycznych wędrują do grasicy gdzie dojrzewają. Proces ten dzieli się na dwie fazy:

1. faza I – gdzie najmniej dojrzałe komórki, tzw. tymocyty, które pod wpływem cytokin i komórek tworzących zrąb grasicy zaczynają intensywnie proliferować następuje rearanżacja genomu i wytworzenie TCR (receptorów): najpierw genów kodujących łańcuch beta TCR (tzw. selekcja beta)

2. faza II – w limfocytach, w których doszło do selekcji beta dochodzi do wykluczenia allelicznego

3. faza II późna – wytwarzanie cząsteczek CD4 i CD8. Następuje rearanżacja genów kodujących łańcuch alfa TCR. W wyniku tych procesów powstaje duża pula limfocytów dwudodatnich posiadających CD4 i CD8 i mają też TCRαβ

4. faza III – tak ukształtowane komórki poddane są edukacji i tolerancji na własne antygeny, oraz funkcji eliminowania obcych (selekcja pozytywna i negatywna)

W rezultacie grasice opuszczają limfocyty jednododatnie CD4⁺ TCR i CD8⁺ TCR i są to limfocyty cytotoksyczne i pomocnicze

Selekcja jest bardzo silna, bo tylko 10% opuszcza grasicę

1. Limfocyty T na różnych etapach różnicowania różnią się fenotypowo – mają inny skład elementów powierzchniowych tzn. jedne zanikają a inne pojawiają się na późnych etapach i zostają do końca

np. Tdt – terminalna transferaza – jest tylko z limfoblastach (nisko zróżnicowanych limfocytach) występujących w przedgrasiczu kora grasicy (I faza i II faza) rdzeń (III faza) i krążenie – już ich nie ma

• podobnie jest z limfocytami B, które również zmieniają swój obraz immunofenotypowy w procesie dojrzewania. One też ulegają selekcji, ale jest ona mniej precyzyjna ze względu na to, że podczas odpowiedzi immunologicznej pomagają im limfocyty T

• czynnikiem determinującym różnicowanie się limfocytów B jest czynnik transkrypcyjny PAX 5

• preproB – najniżej zróżnicowane limfocyty, które mają CD34 i CD10; pierwsze

Jeżeli jest ich dużo można podejrzewać ostrą białaczkę limfoblastyczną

BCR – geny RAG1 i RAG2 są produktami, które uczestniczą w rearanżącji genu BCR

• kolejne w kolejności są komórki proB, które mają już cząsteczki Igα i Igβ, charakteryzują się one CD19 i mają antygeny HLA klasy II

• kolejny etap: limfocyty preB: zaczynają się pojawiać łańcuchy ciężkie, ale w cytoplazmie, które następnie są stopniowo wyrzucane na powierzchnię. W niedojrzałych limfocytach B kończy się proces rearanżacji dla łańcuchów lekkich i zaczyna się tworzyć BCR – tworzy go cząsteczka IgM i IgD. Kończy się w nich ekspresja CD10

• dojrzałe limfocyty B – CD21 i CD23

1. Populacje i subpopulacje limfocytów

1. limfocyty T – stanowią 70%

ekspresja cząsteczek: TCR, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD28, CD40L

• limfocyty Th pomocnicze (wytwarzają różne rodzaje cytokin)

• Th1 – działają pomocniczo w odpowiedzi typu komórkowego. Wytwarzają IL-2 (stymulacja cytotoksyczna) i interferon gamma (aktywacja makrofagów)

• Th2 – bierze udział w odpowiedzi humoralnej. Wytwarza IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13. Obserwujemy tu dewiację immunologiczną – antagonizm pomiędzy dwoma typami odpowiedzi immunologicznej

• Th0 – wydzielają zarówno cytokiny Th1 i Th2

• Th17 – wydzielają duże ilości IL-17 – stymuluje wydzielanie cytokin odpowiedzialnych za wytworzenie neutrofilów i szybką reakcję zapalną

• limfocyty Treg

ekspresja cząsteczek – CD4⁺, CD25⁺ i Foxg3⁺ (czynnik transkrypcyjny)

• odpowiadają za mechanizmu regulujące wygaszanie odpowiedzi immunologicznej w momencie kiedy są one niepotrzebne (limfocyty T)

• hamują aktywność autoreaktywnych limfocytów (takich, które atakują własne tkanki) – nie jest to jednak 100% działanie

• odpowiadają też za tolerancję przeszczepów allogenicznych

• ich obecność ma też negatywny aspekt – ograniczają odpowiedź immunologiczną w przebiegu choroby nowotworowej

• limfocyty Tc cytotoksyczne – zabijanie komórek zakażonych i nowotworowych

• Tαβ – CD8⁺

• Tαβ – CD4⁺

• Tϒδ – jest ich mało, są prymitywne i rozpoznają antygeny nie poddane obróbe i nie w warunkach restrykcji co oznacza, że nie potrzebują udziału HLA w rozpoznaniu

• NKT

• NK – usuwają komórki zainfekowane i nowotworowe, stanowią 13-19% populacji krwi obwodowej i nie mają CD3^-, lecz CD16⁺ (receptor dla frag. Fc i IgG) i CD56⁺ (izoforma cząsteczek adhezji komórek nerwowych

• LAK

• po co dwa takie same typy komórek zdolnych do tego samego?

zabijają one różne komórki np. Tc potrzebują HLA, a NK zabijają gdy komórka docelowa nie ma cząsteczki HLA (np. komórki nowotworowe). Mają urządzenie – receptor killer, który hamuje działanie (inhibitor zabijania). A zatem one uzupełniają się

1. limfocyty B

ekspresja cząsteczek: BCR, MHC I (wszystkie komórki jądrzaste mają) i II (mają tylko komórki prezentujące antygen), CD19, CD20, CD21, CD22, CD32, CD35, CD40, CD72, CD80 i CD86

• limfocyty B1 – 20% limfocytów krążących i śledzionowych

• B1a – CD5⁺, receptory dla autoantygenów, białaczki

• B1b – CD5^-

uczestniczą w pierwotnej odpowiedzi; nie różnicują się w komórki pamięci

• limfocyty B2, konwencjonalne, przeważają ilościowo, nie posiadają CD5

1. Krążenie limfocytów

• Limfocyty cały czas krążą, aby rozpoznać wreszcie antygen

• jeśli to nie nastąpi są usuwane na drodze apoptozy

• są uwolnione z żyłek z wysokim śródbłonkiem HEF, a reszta leukocytów przechodzą przez żyłki pozawłosowate narządów nielimfatycznych

• etapy opuszczania naczyń przez limfocyty:

1. toczenie się limfocytów po śródbłonku – limfocyt dotyka ściany naczynia włosowatego i dochodzi do wiązania się komórek śródbłonka z limfocytem za pośrednictwem selektyn (cząsteczki adhezyjne)

Wyróżniamy:

• P – selektyny – występują na komórkach śródbłonka, ligand komórek krwi

• E – selektyny – na komórkach śródbłonka, ligand na leukocytach

• L – selektyny – występują na komórkach leukocytów, ligand w żyłkach z wysokim śródbłonkiem endotelium

1. aktywacja toczącego się po śródbłonku limfocytu

Aktywacja następuje pod wpływem chemokin, które wędrują z tkanek na powierzchnię śródbłonka i przyczepiają się do niego za pomocą „ogonka”, którym są GAG

1. ścisła adhezja toczącego się, zaktywowanego limfocytu za pomocą cząsteczek – integryn. Warunkuje proces ścisłego przylegania limfocytów do naczynia

2. diapedeza – przenikanie leukocytu

Migracji limfocytów w tkance sprzyjają różne enzymy: plazmina, katepsyna, proteazy serynowe

1. Prezentacja antygenów limfocytom T

• łączenie endogennych peptydów z cząsteczkami MHC klasy I

antygen ulega degradacji, aby go skrócić przez ubikwintyzację i przyłączają się do proteasomów. Te za pomocą TAP1 i TAP2 wędrują do ER gdzie wiążą się z peptydem HLA i dalej są wyrzucane na zewnątrz i prezentowane limfocytom

Prezentują peptydowe elementy organizmu

1. Komórki prezentujące antygen:

• CD1 – prezentują gliko i fosfolipidowe elementy organizmu

• makrofagi – fagocytują antygen

• limfocyty B

• komórki denrytyczne – pinocytują antygen

• posiadają liczne wypustki boczne umożliwiające kontakt z innymi komórkami układu odpornościowego

• ich rolą jest prezentacja antygenu

• np. komórki Langerhansa LH – skóra

komórki splatające się IDC – strefa grasiczozależna węzłów chłonnych

komórki grudkowate – ma iccosomy, czyli miejsca koncentracji. One nie krążą we krwi, lecz są w węzłach i przejmują antygeny od innych komórek.