Zwierzęta jako bioreaktory:
rok 1920: pierwsze zastosowanie białek jako terapeutyków (insulina z trzustki świńskiej) Pozyskiwanie białek do celów naukowych, badawczych, terapeutycznych
Izolacje z tkanek, w których białka te są produkowane - często długotrwałe, skomplikowane, dostarczające zbyt małych ilości
Klonowanie genów kodujących i ekspresja w układach heterologicznych
Białka rekombinowane: Pod pojęciem białek rekombinowanych rozumiemy białka otrzymane in vitro, przez wprowadzenie obcego DNA do komórek-gospodarza, lub białka powstające z połączenia 2 lub większej ilości genów, które pierwotnie były odpowiedzialne za produkcję niezależnych białek. Produktem genu fuzyjnego jest białko (polipeptyd), którego funkcja jest w pewnym stopniu pochodną funkcji białek kodowanych przez geny wchodzące w skład takiego połączenia. Ich zastosowanie pozwala na wydajną produkcję tych białek/peptydów, które w naturalnych warunkach występują w niewystarczających ilościach, np. insuliny stosowanej w medycynie, czy podpuszczki niezbędnej do produkcji serów.
rok 1980: pierwsze białka rekombinowane; insulina, hormon wzrostu
Systemy ekspresji stosowane do produkcji białek rekombinowanych
Bakterie: E. coli, B. subtilis
Drożdże: S cereviseae, P. pastoris K. lactis
Grzyby strzępkowe
Algi
Komórki owadzie
Komórki CHO
Transgeniczne rośliny i zwierzęta
Systemy ekspresyjne E. coli są najczęściej stosowane do nadprodukcji rekombinowanych białek.
dobrze poznana sekwencja genomu,
najlepiej zdefiniowany układ transkrypcyjny i translacyjny,
duży wybór opisanych promotorów, replikonów oraz mutantów,
łatwość ich samodzielnego przygotowania,
możliwość prowadzenia hodowli w tanich pożywkach i z wykorzystaniem tak prostych czynników selekcyjnych jak antybiotyki.
Trudności nadal sprawiają białka bardzo duże, zawierające liczne mostki dwusiarczkowe, liczne niesparowane grupy tiolowe oraz takie, które wymagają modyfikacji potranslacyjnych. W komórkach E. coli z powodzeniem produkuje się interferon, albuminę człowieka, hormony wzrostu i prawie wszystkie rekombinowane enzymy dla diagnostyki i biologii molekularnej
| Organizm- gospodarz | Zalety: | Wady: |
|---|---|---|
| Bakterie np. E coli | -prosta procedura ekspresji. Niski koszt. -bogaty zasób opracowań naukowych, protokołów. -produkt może być wydzielany do emdium hodowlanego -wysoka wydajność produkcji białka heterologicznego nawet do 500mg/l hodowli -bogata oferta skutecznych narzędzi inżynierii genetycznej. |
-nie zachodzi proces modyfikacji potranslacyjnych -nadprodukcja białka może prowadzić do powstania ciałek inkluzyjnych -aktywność biologiczna może być odmienna od aktywności biologicznej formy natywnej. -potencjalna immunogenność -białka o masie cząsteczkowej powyżej 30kDa mogą być nieprawidłowo fałdowane. Różnice w ‘codon usage’. |
| Drożdże np. Pichia, Saccharomyces cerevisiae. | -szybki wzrost i tempo przyrostu biomasy oraz wysoki plon końcowy biomasy -dobrze opracowane metody w skali przemysłowej -brak endotoksyn i onkogenów -tworzenie mostków dwusiarczkowych –N i –O- glikozylacji, acylacja, acetylację, fosforylacja -śladowa ilość natywnych białek wydzielanych na zewnątrz pozwala na łatwe oczyszczenie heterologicznego białka wydzielanego do medium hodowlanego. |
-mannozylacja różna niż w komórkach ssaków ‘przeglikolizowanie’ -możliwa immunogenność produkowanych białek |
| Komórki owadów, bakulowirusowe systemy ekspresyjne | -wysoka wydajność ekspresji heterologicznych białek, przy jednoczesnych obniżeniu syntezy białek -przeprowadzenie kompleksowych modyfikacji potranslacyjnych. |
-brak możliwości syntezy glikoprotein o strukturze N-glikanu z terminalnymi łańcuchami kwasu sjalowego -nie zawsze w pełni funkcjonalny produkt -ekspresja nieciągła. |
| Komórki ssacze np. CHO | -modyfikacje potranslacyjne podobne do ludzkich -dostępność wektorów ekspresyjnych -możliwość prowadzenia hodowli na dużą skalę. |
-wysokie koszty, skomplikowana technologia -powolny wzrost komórek -niestabilność wprowadzanych zmian -niska produktywność |
| Rośliny | -ekonomiczne do przyrostu biomasy, niezbędna tylko energia słoneczna i podłoże mineralne -gotowe rozwiązania technologiczne -możliwość pominięcia etapu izolacji produkowanego białka np. w przypadku jadalnych szczepionek -sterylność wykluczająca zakażenie wirusami czy prionami |
-niska wydajność zarówno transformacji jak i ekspresji -problemy z optymalizacją procesu regeneracji roślin transgenicznych -długi czas generacji -różnice w sposobie glikozylacji, w odniesieniu do ssaczych systemów ekspresyjnych. |
| Zwierzęta transgeniczne | -modyfikacje potranslacyjne zbliżone do ludzkich. | -wysoki koszt -potencjalna możliwość zakażeń wirusami czy prionami -dylematy etyczne. |
Cele modyfikacji genetycznej zwierząt
W 1980 roku po raz pierwszy uzyskano transgeniczne zwierzę - mysz. Od tamtej pory liczba zwierząt modyfikowanych genetycznie zwiększa się.
Cel 1 - naukowy (poznawczy), ma on na celu poznanie genetycznej kontroli systemów fizjologicznych zwierząt i człowieka oraz opracowanie modeli chorób genetycznych. W badaniach medycznych modele zwierzęce przybliżyły naukowców do odpowiedzi na pytania o otyłość, cukrzycę, karłowatość, choroby układu krążenia, są również świetnym modelem do testowania nowych metod leczenia. Myszy, którym wszczepiono dodatkowy gen, lub te którym go usunięto (nokaut genu) dostarczyły cennych informacji dotyczących poznania procesów nowotworzenia, podziału komórek i rozwoju organizmu.
Cel 2 - cel praktyczny, który obejmuje poprawę cech użytkowych, biomedyczne wykorzystanie produktów uzyskanych ze zwierząt genetycznie zmodyfikowanych, które służą jako bioreaktory. Praktyczny cel tworzenia zwierząt genetycznie zmodyfikowanych, to głównie:
1. Szybsze i kontrolowane rozmnażanie,
2. Większa odporność zwierząt na choroby i pasożyty (np. odporność kur na wirusa ptasiej grypy, odporność krów na priony powodujące BSE, czyli tzw. „chorobę szalonych krów”)
3. Poprawa jakości produktów żywnościowych:
-Większy przyrost i lepsza jakość wełny,
- Większy przyrost tuszy i lepsza jakość mięsa, efekt ten uzyskano po wprowadzeniu genu produkującego hormon wzrostu m.in. do karpia, królika, świni,
- Większa wydajność i jakość mleka. Wydajność została osiągnięta przez wprowadzenie genu kodującego białka, beta-, kappa- kazeinę.
4. Wykorzystanie zwierząt w celach biomedycznych: - Wykorzystanie ksenogenicznych organów i tkanek do transplantacji - Otrzymywanie białek o znaczeniu farmaceutycznym ze względu na możliwość wykorzystywania zwierząt jako „bioreaktorów”. Zmodyfikowane zwierzęta, z wprowadzonym obcym genem, mogą produkować cenne farmakologicznie preparaty, które dzisiaj izolowane są np z ludzkiej krwi. Możliwość łatwego i taniego odzyskania znacznych ilości wytworzonego przez zwierzęcy bioreaktor terapeutyku, bez konieczności zabijania zwierzęcia daje wykorzystanie naturalnych systemów wydzielniczych i produkcji białek wydzielanych wraz z płynami ciała:
-wydzielina gruczołu mlekowego ssaków
- krew
- jajo kurze
- nasienie
- mocz
- wydzielina gruczołów przędnych jedwabników
W 2006 roku Europejska Agencja ds. leków jako pierwsza na świecie zezwoliła na stosowanie środka otrzymywanego z mleka genetycznie modyfikowanych kóz. Preparat ATryn, który jest przeznaczony dla osób z wrodzonym niedoborem antytrombiny (AD). Ta dziedziczna choroba krwi może zagrażać życiu, szczególnie w sytuacjach wysokiego ryzyka powstania zakrzepów, np.: ciąża/poród, zabieg chirurgiczny. Firma biotechnologiczna z Massachusetts GTC Biotherapeutics wprowadziła ludzki gen odpowiedzialny za wytwarzanie antytrombiny u zdrowego człowieka do genomowego DNA kozy. Dzięki temu naukowcy otrzymali zwierzę, które wytwarza dużą ilość leczniczego białka.
Tworzenie transgenicznych „zwierząt bioreaktorów”
Wprowadzanie obcego DNA przy zastosowaniu retrowirusów i lentiwirusów
Mikroiniekcja do przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej
Iniekcja embrionalnych pluripotencjanych komórek macierzystych (ES) i komórek linii zarodkowej (EG), do których uprzednio wprowadzono transgen (na etapie blastocysty) – rekombinacja homologiczna
Wprowadzanie DNA poprzez „modyfikacje/opłaszczanie”: nasienia i procesie zapłodnienia in vitro liposomy na drodze elekrotoporacji nasienia/komórki jajowej/embrionu
Przeniesienie jądra komórkowego do „pustej” komórki somatycznej, ES, EG.
W zapłodnionej komórce jajowej obcy DNA wprowadzany jest do jednego z dwóch przedjądrzy, które reprezentują, męskie i żeńskie, haploidalne jądra komórkowe przed ich fuzją prowadzącą do powstania zygoty.
*Gene-targeted transgenic approach -W tej metodzie, do wprowadzenia transgenu wykorzystuje się pluripotencjalne embrionalne komórki macierzyste (ES), które poddaje się transfekcji in vitro.
Białka produkowane przez transgeniczne zwierzęta
-Hormon wzrostu - produkowany pierwotnie w komórkach E. coli - gen wprowadzony w wektorach retrowirusowych do komórek gruczołów sutkowych obecnie produkowany w mleku transgenicznych królików, kóz i krów z wydajnością 5g/l mleka
-Laktoferyna - białko o właściwościach antybakteryjnych i immunostymulujących , naturalnie występuje w mleku , łzach - produkowana w mleku kóz 2,6 g/l
-Erytropoetyna - hormon regulujący produkcję czerwonych krwinek, powstaje w nerkach - produkcja do leczenia anemii (przy niewydolności nerek, chemioterapii) - wytwarzana przez transgeniczne króliki, świnie i kozy 2g/l
-Insulinopodobny czynnik wzrostu - wykorzystywany min. w leczeniu zaburzeń wzrostu i cukrzycy typu 1 i 2 - produkowany w E. coli - w 1994 uzyskany w transgenicznych królikach 1g/l
-Antytrombina - odpowiada za usuwanie skrzepów - uzyskiwany z mleka transgenicznych kóz 20g/l – preparat ATryn od 2006 jako lek .
Zwierzęta transgeniczne: knock out/kock in genów
Model badawczy – MYSZ
- wysokie podobieństwo z genomem ludzkim 99%
- możliwość wywołania chorób ludzkich (chorób układu krążenia, cukrzycy)
- niski koszt utrzymania zwierząt i szybki czas generacji (ok. 9 tyg), duża liczba młodych w miocie
- postęp w biologii molekularnej i w zakresie badań i zastosowania komórek macierzystych pozwolił na rutynowe tworzenie tak modyfikowanych zwierząt.
| Mysz knock out/ knock in | Mysz transgeniczna |
|---|---|
Utworzona przy zastosowaniu rekombinacji homologicznej w kom ES - Wprowadzany gen zastępuje prawidłowy/nieprawidłowy gen w jego oryginalnym miejscu na chromosomie - Zazwyczaj homozygoty pozwalają na najwyższą ekspresję - Cel: zastąpienie prawidłowego/nieprawidłowego genu |
Utworzona za pomocą injekcji DNA do zapłodnionego jaja - Gen integruje z genomem w przypadkowe miejsca - Wiele kopii powtórzonych tendemowo - Poziom ekspresji jest ściśle uzależniony od miejsca integracji - Cel: wprowadzić nowy materiał genetyczny |
Technika knock out’u polega na zniszczeniu ciągłości wybranego genu, w wyniku czego można prześledzić (na poziomie komórki, tkanki czy całego organizmu) zmiany fenotypowe towarzyszące brakowi danego białka.
Komórka macierzysta to komórka posiadająca zdolność do samoodnawiania oraz różnicowania w komórki potomne.
Komórki macierzyste ze względu na zdolność do różnicowania dzielą się na:
- totipotencjalne (totipotentne) - mogą różnicować się do każdego typu komórek danego organizmu, jest to komórka powstała w wyniku zapłodnienia - zygota, lub komórki blastuli do stadium kilku blastomerów, komórki totipotencjalne są zdolne do wykształcenia całego organizmu, są najbardziej pierwotnymi komórkami,
- pluripotenjalne (pluripotentne) - mogą dać początek każdemu typowi komórek różnicując się do każdego z trzech listków zarodkowych: mezodermy, ektodermy i endodermy, nie mogą jedynie już przekształcić się z powrotem w komórki totipotencjalne
- multipotencjalne (multipotentne) - mogą przekształcać się w we wszystkie typy komórek w obrębie danego listka zarodkowego, np. w obrębie mezodermy mogą dać początek komórkom szpiku, krwi lub mięśni, do tej grupy należą komórki macierzyste, których źródłem jest krew pępowinowa,
- unipotencjalne (unipotentne) - różnicują się tylko do jednego typu komórek dojrzałych, jednak w przeciwieństwie do nich posiadają zdolność do podziałów, są to np. komórki warstwy ziarnistej naskórka regenerujące naskórek (keratynocyty).
Pula komórek macierzystych utrzymuje w równowadze liczbę komórek somatycznych organizmu. Za najbardziej prymitywną komórkę macierzystą można uznać zygotę – komórka totipotencjalna. Podczas embriogenezy z totipotencjalnej komórki macierzystej powstaje embrion i łożysko. Komórki węzła zarodkowego (embrioblastu) blastocysty są pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Komórki pluripotencjalne dają początek komórkom macierzystym poszczególnych trzech listków zarodkowych (ektodermalne, mezodermalne, endodermalne) – komórki multipotencjalne. Podczas embriogenezy z komórek multipotencjalnych powstają komórki macierzyste poszczególnych tkanek i narządów – ukierunkowane tkankowo komórki macierzyste (naskórek, wątroba, mięśnie, krew, nerwy i inne).
Komórki macierzyste cd:
Pobranie komórek ES z embrionu przed jego implantacją pozwala na uzyskanie i namnożenie w hodowli in vitro populacji tych komórek i utrzymanie jej przez nielimitowany okres czasu
Nawet po wprowadzeniu do nich DNA mysie komórki ES wytworzą embrion po umieszczeniu ich ponownie w blastocyście
Implantacja blastocysty do matki zastępczej pozwala na uzyskanie potomstwa „chimerycznego” – których tkanki zbudowane są z dwóch rodzajów komórek : kom. embrionu i zmodyfikowanych komórek ES.
Chimera – organizm zbudowany z komórek różniących się genetycznie. Wśród zwierząt chimery mogą powstać np. wskutek podwójnego zapłodnienia komórki jajowej, połączenia zarodków lub częściowej wymiany komórek pomiędzy zarodkami. Powstały osobnik ma niektóre narządy zbudowane z komórek o innym składzie niż reszta jego organizmu.
Knock out- Mysz zmodyfikowana genetycznie – jeden lub kilka „wyłączonych” genów.
- Ważny model do badań nad genami, które zostały zsekwencjonowane, ale ich funkcja pozostaje nieznana
Transgeneza- Technika pozwalająca na wprowadzanie genów lub ich zmienionych form do organizmu.
-Nie powoduje zamiany genu, ale wprowadzenie dodatkowej jego kopii.
Wprowadzenie DNA do komórek eukariotycznych:
W obu technikach należy DNA wydajnie wprowadzać do komórek eukariotycznych
-Strącanie za pomocą jonów Ca2+
-Zastosownie liposomów
-Mikroinjekcja
-Elektroporacja
- DNA ulega wytrąceniu pod wpływem CaPO4 - kompleksy są pobierane do komórek transportowane do jądra komórkowego, gdzie mogą być ekspresjonowane
- Liposomy – sztuczne błony komórkowe tworzone w probówce , DNA jest mieszane z poszczegółnymi komponentami w określonych warunkach. Następuje enkapsulacja DNA wewnątrz takiej syntetycznej błony, która ulega fuzji z plazmalemmą, DNA jest wtedy uwalniane i wprawadzane do jądra komórkowego (mechanizm nieznany)
-Elektroporacja - zastosowanie pola elektrycznego do odwracalnego uszkodzenia błony komórkowej w celu dokonania transformacji komórek.
Wbudowywanie DNA w komórce:
-Wewnątrz komórki naprawczy aparat enzymatyczny łączy fragmenty z chromosomem
-Nowy fragment może wymienić się z genem na drodze rekombinacji homologicznej, przypadkową lub pozostać niezależną pozachromosomalną cząsteczką DNA tworząc tzw. episom
Rekombinacja homologiczna - zachodzi między cząsteczkami DNA o wysokiej homologii, np. wewnątrz genomu diploidalnego organizmu. Wymaga ona obecności odpowiednich enzymów lub szlaków enzymatycznych umożliwiających kolejno zerwanie i połączenie przylegających do siebie homologicznych fragmentów DNA. Ważną rolę w jej przebiegu odgrywa białko RecA, aktywowane przez ATP. Ułatwia ono jednoniciowemu DNA szybkie przeszukiwanie dupleksu w celu znalezienia identycznych lub podobnych sekwencji, a następnie katalizuje wymianę nici w miejscu największej homologii.
Nukleotydy jednej nici DNA łączą się z nukleotydami homologicznymi drugiej, ale zanim to nastąpi chromosomy homologiczne ustawiają się równolegle do siebie, po czym następuje przecięcie nici w kilku miejscach. Następnie fragment homologiczny jednej nici łączy się z fragmentem drugiej krzyżowo, kolejne dwie nici nie są połączone krzyżowo.
Rekombinaza Cre - topoizomeraza typu I pochodząca z bakteriofaga P1, która katalizuje zlokalizowaną rekombinację cząsteczek DNA między sekwencjami zwanymi loxP.
Topoizomerazy I - hydroliza wiązań - nacięcie jednej/dwóch nici, za usuwanie (relaksacja) z cząsteczki DNA superskrętów.
System używany do tak zwanej rekombinacji zlokalizowanej, warunkowej/indukowanej ekspresji genów (conditional gene inactivation). Pozwala on na ekspresję lub „zknock-outowanie” wybranego genu, tylko w pewnych typach komórek lub też w wybranym czasie. Aby taka zlokalizowana rekombinacja mogła jednak nastąpić należy najpierw skonstruować a potem skrzyżować dwie linie myszy. Jedna z nich musi zawierać gen otoczony sekwencjami loxP, czyli gen który będzie celem rekombinazy Cre. Druga linia natomiast musi zawierać gen kodujący rekombinazę Cre. W zależności od właściwości promotora kierującego ekspresją Cre, wycięcie genu może nastąpić tylko w wybranych komórkach, w których obecny będzie ten enzym. Rekombinacja zlokalizowana zachodzi między odcinkami DNA zawierającymi homologiczne fragmenty genomu.
Sekwencja loxP ma długość 34 par zasad i składa się z dwóch odcinków o długości 13 pz o identycznej sekwencji ale odwrotnej orientacji, które otaczają rdzeń - asymetryczną sekwencję o długości 8 pz.
W biologii molekularnej system Cre/loxP umożliwia ukierunkowane wycinanie fragmentów genomu. Do genomu organizmu należy wprowadzić gen kodujący rekombinazę Cre, a także umieścić elementy loxP w taki sposób, aby otaczały gen, który ma zostać usunięty. Kiedy komórka rozpocznie produkcję rekombinazy Cre, gen otoczony sekwencjami loxP zostanie wycięty.
Dzięki umieszczeniu genu Cre pod kontrolą odpowiedniego promotora (np. tkankowo-specyficznego lub indukowalnego) można pozbawić organizm genu tylko w niektórych tkankach lub w odpowiedzi na określone czynniki. Do ekspresji tkankowo-swoistej lub knock’outów letalnych.
Identyfikacja komórek transgenicznych:
Wymagana ze względu na niską wydajność transformacji komórek
- W większości wypadków konstrukt zawiera dwa dodatkowe geny
- Frakcja komórek w których zaszła homologiczna rekombinacja jest identyfikowana zarówno w selekcji negatywnej jak i pozytywnej.
Selekcja pozytywna i negatywna:
Selekcja pozytywna - jeden z genów dodatkowych neoR odpowiada za oporność na neomycynę pozwala na wybranie tych komórek, które sa oporna na antybioityk, bez względu na to, czy przyjęły dany konstrukt na drodze rekombinacji homologicznej czy przypadkowej integracji do genomu.
Selekcja negatywna- gen kinazy tymidylowej z wirusa Herpes Simplex (tkHSV) nadaje komórkom wrażliwość gancyklowir (cytotoksyczny analog nukleotydów)- eliminacje komórek, które przyjęły dany konstrukt na drodze przypadkowej integracji do genomu
-Tylko komórki ES w których zaszła rekombinacja homologiczna są wyodrębnione w wyniku zastosowania w/w systemu selekcji.