Inżynieria genetyczna

Laboratorium

Ćwiczenia II i III

TWÓJ BIOTECHNOLOG

https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

CELE ĆWICZENIA II

Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania – elektroforeza preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu. Elucja DNA z żelu agarozowego (metoda Gel-Out^®; A&A Biotechnology).

ODCZYNNIKI ORAZ APARATURA

• Bufor 1xTBE

• Bromek etydyny

• Bufor 6xSBRoztwór R7S

• Izopropanol

• Roztwór A1- roztwór płuczący.

• Bufor TE.

• aparat BIO-RAD

• pipety automatyczne

• transiluminator UV

• termomikser Eppendorf

• mikrofalówka

• waga laboratyjna RADWAG

• narzędzie do wycinania fragmentów agarozy z żelu " X-tracta Gel Extractor Tool", firma "PROMEGA"

PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA

Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania – elektroforeza preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu.

Zlinearyzowany i defosforylowany plazmid pGEX-2T poddaliśmy horyzontalnej elektroforezie preparatywnej w żelu agarozowym o stężeniu 0.8%, przygotowanym w 1xTBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0.4 μg/ml. Wymiary żelu wyniosły 72x85x5 mm. Elektroforezę prowadziliśmy w buforze 1xTBE, przy stałym napięciu 80 V, przez około 30 minut.

Przygotowaliśmy próbki do naniesienia na żel preparatywny mieszając 20 μl mieszaniny po defosforylacji oraz 4 μl buforu do nanoszenia próbek na żel agarozowy (6xSB) i odwirowaliśmy.

Po przygotowaniu próbki inkubowaliśmy ją w termomikserze Eppendorf w temperaturze 65° C przez 10 minut, następnie schłodyiliśmy próbkę na lodzie i przeprowadziliśmy elektroforeze. Następnie na żel agarozowy nanieśliśmy po 24µl każdej z przygotowanych próbek defosforylowanego wektora pGEX-2T oraz 7µl markera wagowego FastRuler™ DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas).

Żel analizowaliśmy w świetle UV przy długości fali 365 nm, taka długość fali nie powoduje powstawania mutacji badanego fragmentu DNA. Przed rozpoczeciem badań, żel został „niecelowo” upuszczony na podłogę i uległ rozczłonkowaniu. Wszystkie kawałki zostały jednak odnalezione i zlożone w jedną całość. Pozwoliło nam to pobrać próbkę żelu, która zawierała prawdopodobnie dużą ilością zanieczyszczeń. Pożądany fragment DNA pobraliśmy z żelu przy użyciu "X-tracta Gel Extractor Tool" firmy "PROMEGA" . Pobraną próbkę przenieśliśmy do zważonej i opisanej wcześniej eppendorfki i ponownie zważzliśmy na wadze laboratoryjnej RADWAG.

WAGA ŻELU
probówka z żelem – 0.982 g

pusta probówka – 0.918 g -
masa żelu – 0.064 g = 64 mg

Elucja DNA z żelu agarozowego (metoda Gel-Out^®; A&A Biotechnology).

Do wyciętego skrawka agarozy dodaliśmy 400 μl roztworu R7S.

Zawartość probówki wymieszaliśmy i inkubowaliśmy w termomikserze Eppendorf, w temperaturze 50⁰C, przy obrotach równych 500 rpm, do momentu rozpuszczenia agarozy. Podczas rozpuszczania od czasu do czasu bardzo delikatnie mieszaliśmy zawartość probówki.

Następnie dodaliśmy 200 μl izopropanolu i dokładnie wymieszaliśmy.

Mieszaninę krótko odwirowaliśmy w celu usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki.

Otrzymaną mieszaninę nanieśliśmy na kolumnę do oczyszczania DNA, a następnie całość wirowaliśmy około 30 s, przy 10000 x g.

Wyjęliśmy kolumnę z probówki, przesącz (bez DNA) przenieśliśmy do czystej probówki Eppendorfa, a kolumnę ponownie włożyliśmy do probówki. Na złoże w kolumnie nałożyliśmy 600 μl roztworu A1 do płukania.

Wirowaliśmy około 30 s, przy 10000 x g.

Wyjęliśmy kolumnę z probówki, przesącz odrzuciliśmy, a kolumnę ponownie włożylismy do probówki. Na złoże w kolumnie nałożyliśmy 300 μl roztworu A1 do płukania (dwa razy po 150 µl).

Wirowano około 2 min przy 10000 x g.

Wyjęliśmy kolumnę z probówki, przesącz odrzuciliśmy, a kolumnę ponownie włożyliśmy do probówki. W celu osuszenia złoża, kolumnę z probówką inkubowaliśmy około 2 minuty w temperaturze pokojowej.

W celu elucji DNA, osuszoną kolumnę umieściliśmy w pustej, podpisanej probówce Eppendorfa i na kolumnę nałożylismy 15 μl buforu TE tak, aby całkowicie pokryć złoże. Czynność powtórzyliśmy.

Pozostawilismy kolumnę na około 3 minuty w temperaturze pokojowej.

Wirowaliśmy 1 minutę przy 10000 x g.

Otrzymany przesącz zawierający zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony plazmid pGEX-2T oddaliśmy do przechowania w temperaturze -20⁰C.

MASA PRÓBKI PO ELEKTROFOREZIE

m_probki = 0.982g − 0, 918g= 0,064 g = 64mg

Otrzymana objętość: V=26µl

WNIOSKI

Cele doświadczenia został osiągnięty wyizolowaliśmy i oczyściliśmy DNA z żelu agarozowego. Zastosowana przez nas elektroforeza preparatywna to właśnie jednym ze sposobów oczyszczenie DNA, w celu przygotowania kwasu nukleinowego potrzebnego do różnych reakcji, np klonowania. W naszym eksperymencie wykorzystana została zdolność wiązania DNA do złoża krzemionkowego w wysokim stężeniu soli chaotropowych. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA łączą się w dużym stężeniu soli do dodatnio naładowanej krzemionki. Zanieczyszczenia są odpłukiwane a następnie DNA wymywany. Aby uzyskać prawidłowe wyniki należy prawidłowo przeprowadyić elektroforeze, stosując odpowiednie, nieybyt wysokie napiecie które może być sprawcą upłynnienia żelu oraz dokładnie odmierzać preparaty.

CELE ĆWICZENIA III

Przygotowanie insertu EcRDBD do klonowania (generowanie miejsc restrykcyjnych BamHI) – reakcja PCR.

Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania – elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji oraz szacowanie jego stężenia.

Elektroforeza analityczna produktów PCR.

PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA

Przygotowanie insertu EcRDBD do klonowania (generowanie miejsc restrykcyjnych BamHI) – reakcja PCR.

Przygotowaliśmy kontrolę mieszając (K) zmieszanie 4,1 µl WR5 (50pmoli), 4,2 µl WR6 (50 pmoli), 8 µl DTP (mieszanina nukleotydów o c=1,25 mM każdego), 2 µl MgCl2 [25 mM] 5 µl buforu polimerazy i 25,7 µl H₂O_{milliQ auto}

Sporządziliśmy mix reakcji PCR w następujący sposób: do 21 μl pBS-EcR/EcoRI (matryca używana w reakcji PCR, którą jest wektor pBlueScript/EcR zlinearyzowany enzymem Eco RI(=> pBS-EcR/EcoRI) o stężeniu 5 ng/µl.) dodaliśmy 28,7 µl WR5 (starter przedni), 29,4 µl WR6 (starter tylny) oraz 56 µl DTP (mieszanina nukleotydów o c=1,25mM każdego), 14 µl MgCl₂ i 35 µl buforu dla polimerazy Taq i dopełniliśmy 159 µl H₂O_{milliQ auto} do objętości 343 µl.

W probówce PCRówce umieściliśmy 49 µl MIXu, który wirowaliśmy przy maksymalnych obrotach wirówki.

Próbki umieściliśmy w termocyklerze oraz zaprogramowaliśmy aparat do reakcji PCR, podczas której:

-najpierw dokonywana była denaturacja w 95 ^oC, przez 180 s – gdzie po tym czasie do próbki dodaliśmy 1 µl roztworu termostabilnej polimerazy DNA Taq (tzw. gorący start),

-następnie dokonywała sie denaturacja w 95 ^oC przez 60 s

-potem stapianie w 58 ^oC przez 30 s.

-polimeryzacja w 72 ^oC przez 30s.- zapętlono do cyklu II i powtórzono ciąg x 5.

-denaturacja w 95 ^oC, 60s.

-stapianie i polimeryzacja w 72 ^oC, przez 60s.- zapętlono do cyklu V i powtórzono 15 razy.

-dokończenie polimeryzacji w 72 ^oC, przez 120s.

-zakończenie, schłodzenie mieszaniny reakcyjnej w 12 ^oC.

Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania – elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji oraz szacowanie jego stężenia.

Do sporządzenia próbki plazmidu pGEX-2T do elektroforezy potrzebne nam było 3 µl roztworu plazmidowego DNA po oczyszczaniu (DNA z ćwiczenia II) oray 7 µl TE i 2 µl 6xbuforu, które umieściliśmy w probówce SB i odwirowaliśmy.

Nanieśliśmy 12 µl próbki do elektroforezy na żel agarozowy oraz 5 µl markera wagowego FastRuler^TM DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas).

Elektroforeza analityczna produktów PCR.

Po przeprowadzeniu reakcji PCR pobraliśmy 5 µl mieszaniny reakcyjnej PCR i przenieśliśmy do probówki Eppendorf i odwirowaliśmy.

Następnie dodaliśmy 5 µl TE i 2 µl 6x SB, ponownie odwirowaliśmy.

Pobraliśmy 21µl próbki, na żel nanieśliśmy marker oraz wektor wagowym i przeprowadzaliśmy elektroforezę przy stałym napięciu 70 V przez 40 min.

Pobraliśmy pozostałą część mieszaniny (ok. 43 µl) i przenieśliśmy ją do czystej i podpisanej probówki Eppendorfa.

WYNIKI ELEKTROFOREZY

	M	1	2	3	4	5	6
5000 bp →		←4948 bp
2000 bp →
850 bp →
400 bp →
100 bp →
	Rys. 1. Elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji. M – marker wagowy FastRuler^TM DNA Ladder, Middle Range (MBI Fermentas) 1,2,3,4,5,6 – wektor poszczególnych grup
	K	M	1	2	3	4	5	6
5000 bp →	Rys. 2. Elektroforeza analityczna produktów PCR M – marker wagowy FastRuler^TM DNA Ladder, Middle Range (MBI Fermentas) K – kontrola (5 µl próbki PCR, 5 µl TE, 2 µl 6x SB) 1,2,3,4,5,6 – produkty PCR poszczególnych grup
2000 bp →
850 bp →
400 bp →
321 bp →
100 bp →

WNIOSKI

Metoda PCR jest to metoda specyficzna ponieważ przy doborze odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA. Jest ona również bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA.

Reakcja PCR jest reakcją opartą na odpowiednich zmianach temperatur, do osiągnięcia których potrzebny jest nam termocykler, który umożliwi nam szybkie zmiany dostosowanych temperatur. PCR składa się z wielu cykli, z których każdy składa się z trzech etapów:

Pierwszym etapem każdego cyklu  jest Denaturacja. Aby polimeraza dostała się do naszego genu musi nastąpić rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA. W wysokiej temperaturze wynoszącej około 95 °C dochodzi do  pękania wiązań wodorowych łączących nici DNA, w  wyniku czego podwójna helisa DNA zostaje rozdzielona na dwa pojedyncze łańcuchy. W tym momencie jest już możliwe przyłączenie się komplementarnych starterów do matrycy DNA. W tym celu obniża się temperaturę, w naszym przypadku do około 45 - 60°C, temperatura ta jest ściśle określona i zależna od składu sekwencji, czyli tego jakie zasady znajdują się w tym odcinku DNA, w naszym przypadku wynosiła ona 58°C.Końcowym etapem jest elongacja. Po przyłączeniu się starterów do matrycy DNA polimeraza DNA może zacząć działać, przyłączając komplementarne trifosforany deoksyrybonukleozydów do matrycowego DNA amplifikowanego genu.  Temperatura stosowana na tym etapie jest temperaturą optymalna dla działania polimerazy i wynosi ona około 72 °C.

Otrzymana wysoka liczba kopii oczekiwanego genu jest następnie przydatna  w wielu dziedzinach życia m.in.: w kryminalistyce, gdzie często dowody w postaci krwi,nasienia, włosa czy śliny zawierają znikome ilości genu potrzebnego do dalszej identyfikacji; w celu wykluczenia lub potwierdzenia ojcostwa; przy diagnostyce chorób.

Aby przeprowadzić reakcję PCR niezbędnych jest kilka reagentówtakich jak: matrycowy DNA zawierający interesujący nas gen, który jest celem amplifikacji, może być ona kolista lub liniowa ale nie może zawierać ona inhibitorów; startery, są nimi krótkie fragmenty DNA, znajdujące się na końcach genu, który będzie amplifikowany. Startery są niezbędne, gdyż kolejny składnik mieszaniny reakcyjnej – termo stabilna Polimeraza DNA Taq jest enzymem, który nie potrafi rozpocząć syntezy nowej nici DNA, bez części początkowej, którą stanowią startery; trifosforany deoksyrybonukleozydów, czyli cegiełki, będące budulcem nowych nici DNA; odpowiedni bufor co stanowi o właściwym środowisku reakcji.