SPRAWOZDANIE

Inżynieria genetyczna - Laboratorium

Ćwiczenie nr 1: Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było przygotowanie kompetentnych komórek XL1-Blue.

2. Procedura i metodyka

4 ml całonocnej hodowli bakteryjnej (wcześniej odpowiednio przygotowanej) przeniesiono do 60 ml świeżej pożywki LB z tetracykliną
o stężeniu końcowym 12,5 µg/ml. Następnie hodowlę inkubowano
w 37°C na wytrząsarce rotacyjnej przy prędkości 182 obr/min przez
87 minut. Pobrano 2 ml kultury i zmierzono gęstość optyczną hodowli (OD₆₀₀) przy λ=600 nm z czystym medium LB jako odnośnik.

Po osiągnięciu wymaganej gęstości optycznej (mieszczącej się w przedziale 0,4 - 0,5) przystąpiono do dalszych czynności. Przelano 10 ml hodowli do zimnej probówki o pojemności 50 ml i ochłodzono w lodzie przez 10 min. Następnie hodowlę wirowano przez 10 min w temp. 4°C przy 4500 x g. Po odwirowaniu supernatant odrzucono, a powstały osad zawieszono w 1,2 ml zimnego roztworu A (100mM MgCl₂). Po zawieszeniu dodano jeszcze 2 ml tego roztworu. Całość inkubowano przez 10 min na lodzie, a następnie wirowano przez 10 min w tych samych warunkach, co poprzednio. Supernatant odrzucono, a osad zawieszono w 1,2 ml roztworu B (100mM CaCl₂), po zawieszeniu dodając jeszcze 2ml tego roztworu. Prowadzono inkubację przez 30 min, od czasu do czasu mieszając. Po tym czasie mieszaninę wirowano przez 10 min w 4°C przy 4500 x g. Supernatant odrzucono, a osad zawieszono w 0,8 ml zimnego roztworu C (100mM CaCl₂, 20% glicerol).

Tak powstałą zawiesinę rozdzielono po 100 µl do 9 probówek Eppendorfa umieszczonych na lodzie. Probówki zamrożono w ciekłym azocie, przeniesiono do schłodzonego pudełka i umieszczono w temp. -80°C.

3. Wyniki i obserwacje

Pierwszy pomiar OD₆₀₀ wykonano po t₁=52min (0,292), następny po
t₂=70min (0,356). Wartość charakterystyczną dla fazy wzrostu logarytmicznego bakterii otrzymano po czasie t₃=87min.

Stężenie początkowe tetracykliny wynosiło C₀=12,5 mg/ml, natomiast wymagane końcowe C_k=12,5 µg/ml. Stąd otrzymano rozcieńczenie R=1000:

(3.1)

Przy 60 ml posiadanej pożywki LB, pobrano 1000x mniej roztworu, aby końcowe stężenie tetracykliny wynosiło 12,5 µg/ml :

(3.2)

(3.3)

Ilości zastosowanych do zawieszenia osadu bakterii roztworów A, B i C wynikają z początkowej objętości hodowli bakteryjnej użytej do pierwszego wirowania (10 ml zamiast zadanych 25 ml). Stąd otrzymano proporcje:

1. 25 ml hodowli - 3 ml roztworu A (lub B)

10 ml hodowli - x ml

x = 1,2 ml

(3.5) 25 ml hodowli - 2 ml roztworu C

10 ml hodowli - x ml

x = 0,8 ml

Te same proporcje dotyczą ilości roztworów dodawanych po zawieszeniu i wynoszą one 2 ml dla roztworów A i B.

4. Wnioski

Inkubowanie komórek bakterii na lodzie stabilizuje ich błony komórkowe, które w naturalnym środowisku są płynne. Dodatnio naładowane jony (m.in. Ca²⁺, Mg²⁺) są w ten sposób zdolne przyłączyć się do ujemnie naładowanych grup fosforanowych w DNA i fosfolipidów błonowych, niwelując sumaryczny ładunek. Pozwala to plazmidowi na zbliżenie się i następnie wniknięcie do wnętrza komórki bakteryjnej przez utworzone mikrokanaliki (pory). Są to tzw. strefy adhezji. Uważa się, że dodatkowy szok temperaturowy pomaga w tym procesie. Jest to zjawisko transformacji i tak przygotowana komórka staje się kompetentna.

Zastosowany roztwór C różni się od pozostałych: dodatkowo, oprócz dwuwartościowych kationów metali, zawiera 20% glicerol. Związek ten stabilizuje komórki bakteryjne i chroni je przed lizą.

Doświadczenie pozwoliło uzyskać kompetentne komórki szczepu Escherichia Coli XL1-Blue, gotowe do przyjęcia plazmidowego DNA.

- 2 -

Maciej Duda 168516

Wojciech Ślęczek 168560

---