PENICYLINA

Szczepy produkujące penicylinę we współczesnej medycynie – wyselekcjonowane mutanty: panicillium chrysogenum

Pradawne szczepy: kilka mg penicyliny/dm³ roztworu penicyliny

Współczesne szczepy: 50g penicyliny/dm³ roztworu penicyliny

Najlepsi producenci dysponują szczepami (postęp biotechnologiczny), które produkują 100g/ dm³ roztworu penicyliny. Szczepy przechowywane są w formie liofilizowanej lub zamrożonej.

Bioreaktory produkcyjne (fermentatory) – mają objętość do 400cm³. Konstrukcja pochodzi z lat 50 i do tej pory niewiele się zmieniło. Są to reaktory półmechaniczne, działające okresowo. Regulacja temperatury, pH, napowietrzania jest sterowana komputerowo (pełna automatyzacja). Mieszadło pracuje z szybkością 25 – 200 obr/min.

Zachowanie sterylności układu jest bardzo ważne – żeby nie rozwijały się inne mikroorganizmy poza tymi pożądanymi. Powietrze jest sterylizowane metodami termicznymi. Aparatura i pożywki sterylizowane są metodami termicznymi lub chemicznymi.

Pożywki

Zawierają:

- źródła C i energii (sacharoza lub glukoza)

-źródła N (jony amoniowe i NO₃^-)

- sole nieorganiczne

- wyciągi mięsne lub inne wyciągi

Pożywki są zestalone agarem (wyciąg z alg). To są pożywki na których rozpoczyna się namnażanie szczepów. Później przenosi się je na pożywki ciekłe, w celu dalszego namnażania:

- namok z kukurydzy

- wyciągi lub hydrolizaty mięsne

- hydrolizaty drożdżowe

Podłoża produkcyjne

Surowce:

- mąka sojowa, kukurydziana

- namok kukurydziany

- wyciągi mięsne

- cukry proste zawierające dwucukry: sacharozę i laktozę, monosacharydy: glukozę i sole mineralne

Neutralizator kwasów: węglan wapnia

Pożywki zawierają jeszcze różne dodatki:

- czynniki wzrostu

- prekursory produktu końcowego (np. pochodne kwasu fenylooctowego)

Zagrożenia biologiczne: zakażenie fagami (wirusami bakteryjnymi). Dla ich wykluczenia konieczna jest dezynfekcja i zastosowanie inhibitorów namnażania fagów:

- kwas askorbinowy

- β-propionolaktony

- glutation (najpowszechniej w przyrodzie rozpowszechniony trójpeptyd)

- pewne środki helatujące

Wydzielanie penicyliny

Penicylina może występować w formie wolnego kwasu, który źle rozpuszcza się w wodzie, a dobrze w rozpuszczalnikach organicznych. W wodzie rozpuszcza się sól penicylinowa kwasu, ale stabilność tego wodnego roztworu jest nie duża.

Oczyszczanie penicyliny polega na ekstrakcji wolnego kwasu do rozpuszczalnika organicznego (np. octan butylu) i reekstrakcja do buforu fosforanowego, w której penicylina jest w formie soli (anionu). Operacja ta prowadzona jest kilkakrotnie, a następnie penicylina w formie wodnej zostaje odwodniona, odbarwiona węglem aktywnym, a następnie przez dodatek nasyconego roztworu wodnego octanu sodu lub potasu wytrącona w postaci soli.

Wyodrębnianie antybiotyku/preparatu paszowego

Mikroorganizmy wytwarzające antybiotyki:

Promieniowce (wytwarzają największą liczbę antybiotyków)

Grzyby strzępkowe (nazywane popularnie pleśniami).

Grzyby: organizmy wielokomórkowe, cudzożywne, niektóre żyją w symbiozie, więc są pasożytami. Zalicza się je do plechowców. Komórka ma wyraźne jądro. Ściana komórkowa jest sztywna i gruba zbudowana jest z chityny, glukanu, lipidów i białek. Plecha zbudowana jest z nitkowatych tworów zwanych strzępkami. Strzępki grzybów niższych nie są podzielone i tworzą jedną komórkę. Wyższych są podzielone ściankami i tworzą 2,3 – komórkowe organizmy. Mają stosunkowo małe wymagania żywnościowe i dużą zdolność do przystosowania się do różnych warunków środowiska (mają intensywną przemianę materii – w ciągu 24godz. Potrafią zwiększyć masę 9 – krotnie). Rosną w warunkach tlenowych. Mogą wytwarzać zróżnicowane produkty przemiany materii:

- antybiotyki

- aflatoksyny (silnie kancerogenne)

Rozwijają się w temp. -10 - +55^oC.Rozmnażają się przez zarodniki lub płciowo. Pędzlaki z rodzaju penicillium to rodzaj grzybów występujących na owocach (tworzą zielony nalot). Z grzybni wyrastają pionowo wzniesione strzępki, które rozwidlają się wielokrotnie, a na końcach powstają zarodniki (konidia) tworząc łańcuszki nadające kształt pędzelków. Konidia służą do rozmnażania bezpłciowego.

Szczep Fleminga: penicillium notatum

Szczep używany w produkcji penicyliny: penicillium chrysogenum (zdolny do produkcji wgłębnej)

Promieniowce: gram+, mają nieregularną, cylindryczną budowę z tendencją do rozgałęziania. Mogą posiadać pseudogrzybnię powierzchniową, wgłębną lub powierzchniową. Rozmnażają się przez podział, fragmentację pseudogrzybni i tworzenie zarodników pseudokonidialnych oraz przez podział poprzeczny pseudostrzępek.

Powszechnie występują w glebie, kompostach i obornikach, a także na produktach spożywczych. Niektóre gatunki mogą wchodzić w symbiozę z roślinami wyższymi.

Regulacja biosyntezy antybiotyków

1. Represja wywołana przez metabolity

2. Represja i hamowanie kataboliczne

3. Indukcja substratowa

4. Indukcja powierzchni przez efektory metaboliczne

5. Regulacja powierzchni przez związki azotu

6. Regulacja fosforanowa i energetyczna

7. Hamowanie w sprzężeniu zwrotnym

8. Regulacja z udziałem pierwiastków śladowych

9. Regulacja przez inne czynniki tj. temperatura, O₂, pH

Represja kataboliczna (przy pomocy źródła C): w obecności glukozy zachodzi szybkie namnażanie komórek i blokada syntezy penicyliny. Problem rozwiązano tak, że początkowo zastosowano mieszaninę glukozy i laktozy jako składnika energetycznego i źródła węgla. Dochodzi wtedy do szybszego wykorzystania glukozy, a następnie powolnego metabolizowania laktozy i wtedy dochodzi do tworzenia penicyliny. Następnie okazało się, że ten sam efekt pojawia się, jeżeli zastosuje się powolne dozowanie glukozy w fazie produkcji antybiotyku.

Wniosek: o produkcji penicyliny nie decyduje rodzaj źródła C, ale tempo jego metabolizowania. Glukoza hamuje syntezę enzymów szlaku biosyntezy antybiotyków.

Mechanizm represji katabolicznej ze strony glukozy lub innych łatwo przyswajalnych źródeł węgla, objawia się przy syntezie wielu innych antybiotyków. Niezależnie stwierdzony inny mechanizm hamowania przez glukozę syntezy enzymów szlaku otrzymywania cefalosporyny C.

Regulacja stężeniem związków azotu: do syntezy penicyliny potrzebne jest źródło azotu. Może to być NH₄⁺, mocznik lub niektóre aminokwasy (L – alanina, kwas L – asparaginowy, L – arginina, L – prolina). W warunkach deficytu białka mogą być to nawet kwasy nukleinowe.

Duże stężenie jonu amonowego hamuje produkcję antybiotyków, ale deficyt tego jonu również hamuje ich syntezę. Dlatego niekiedy do pożywki dodaje się fosforanu magnezowego, ziemi okrzemkowej lub zeolit, które wiążą nadmiar jonów amoniowych, a uwalniają stopniowo w czasie biosyntezy.

Regulacja fosforanowa: jon fosforanowy jest podstawowym składnikiem pożywek. Używany jest w syntezie ufosforyzowanych nukleozydów metabolitów będących efektorami metabolicznymi, które kontrolują różne procesy syntez komórkowych.wzrost następuje w szerokich zakresach: od ułamka, do kilkuset mmoli/l jonu PO₄^3-. Biosynteza antybiotyków wymaga zachowania niewielkiego stężenia jonu, poniżej 10mmol/l, a czasem nawet poniżej 1mmol/l. całkowity brak jonu fosforanowego jest niekorzystne, więc stosuje się zasilanie hodowli tym jonem o bardzo małym stężeniu co zapewnia powolny wzrost organizmów wytwarzających antybiotyk i stymuluje jego syntezę.

Kontrola metaboliczna na zasadzie sprzężenia zwrotnego: końcowy metabolit w nadmiarze blokuje cały szlak metabolizmu inhibując enzym katalizujący pierwszą reakcję szlaku. Np. lizyna hamuje syntezę penicyliny, bo blokuje szlak prowadzący do L – α – aminoadypinianu. Podobnie L – walina i podobna do niej L – leucyna oraz L – izoleucyna, powoduje hamowanie biosyntezy penicyliny.

Penicyliny półsyntetyczne

Rozkład tego wiązania:

enzymy: acylazy penicylinowe rozpad układu β – laktamowego

enzymy: β – laktamazy

(niekorzystne, powodują neutralizację, antybiotyk staje się nieskuteczny)

kwas 6AP

Penicylina V

W 1948 roku stwierdzono, że jeżeli w środowisku pojawi się zamiast kwasy fenylooctowego, kwas fenoksyoctowy to można uzyskać penicylinę V:

Ma lepsze właściwości niż penicylina G, można ją stosować doustnie (penicylinę G należy stosować iniekcyjnie). Penicylina G i V są wspólnie produkowane metodami biotechnologicznymi. Inne penicyliny są produkowane w ten sposób, że wychodzi się z penicyliny G lub V, przekształca ją do kwasu 6AP i jest to substrat wyjściowy do produkcji innych modyfikowanych penicylin.

Półsyntetyczne penicyliny są produkowane aby:

- zwiększyć aktywność

- poszerzyć spektrum działania

- przedłużyć czas działania

- zwiększyć stabilność chemiczną

- poprawić właściwości fizyko – chemiczne (rozpuszczalność, wchłanialność, smak)

- zmniejszyć toksyczność i występowania reakcji alergicznych

- poprawić odporność na dezaktywację enzymatyczną

- zwiększyć odporność na środowisko kwaśne

Metoda chemiczna: podstawową operacją w metodach otrzymywania półsyntetycznych penicylin jest arylowanie kwasu 6AP chlorkami kwasowymi lub bezwodnikami mieszanymi.

Pierwsza pochodną wprowadzoną do lecznictwa była metacylina, która należy do penicylin 3 generacji (jest 6 generacji). Tylko około 30 penicylin weszło do lecznictwa – mniej niż 0,1%.

Cefalosporyna C wykryta u:

- cephalosporium chrysogenium

CEFEPIM (cefalosporyna IV generacji) odkryta w 1993 roku, jest używana w leczeniu ciężkich i powikłanych zakażeń, pasocznic, zakażeń bakteriami wieloodpornymi, w tym zakażeń wewnątrzszpitalnych. Ma:

- bardzo szeroki zakres działania

- poprawione właściwości farmakokinetyczne

- działa na bakterie zarówno G+ i G-

- działa na penicylino odporne szczepy Streptococcus pneumonie

-odporna na działanie β – laktamaz chromosomalnych i plazmidowych

Otrzymywanie kwasu 6AP (hydroliza penicyliny)

Penicylina G lub V

acylaza penicylinowa R₃SiCl

PCl₅

H⁺/H₂O

R₁OH

Droga biotechnologiczna: r. odwracalna. Enzymy katalizujące tą reakcję, katalizują również reakcję odwrotną. Reakcja ta może być wykorzystana do wytwarzania innych modyfikowanych penicylin, ale są one przeważnie otrzymywanie na drodze chemicznej. W środowisku obojętnym (pH 7,5 – 8,5) enzymy te hydrolizują penicylinę G lub V, natomiast w środowisku kwaśnym mogą służyć do biosyntezy nowych pochodnych penicylin.

Źródła enzymu użytego na drodze biotechnologicznej (wyselekcjonowane szczepy bakterii):

- achromobacter spp. Alcaligens faecalis

- escherichia coli

- baccilium megaterium

- proteusz rettgeri

- pseudomonas melanogenes

- drożdże z gatunku klunyvera citropila

Można posługiwać się całymi komórkami lub wyizolowanymi enzymami. W praktyce lepiej izolować enzymy, ponieważ niektóre komórki mogą wydzielać laktamazy. Enzymy wyizolowane poddawane są immobilizacji.

Udoskonalenie enzymów:

- selekcja

- mutageneza

- klonowanie rekombinowanych plazmidów

- przeniesienie genu acylazy do nowego gospodarza

W produkcji wykorzystywane są rekombinowane szczepy E. coli zawierające zwielokrotnioną liczbę (kopii genu) acylazy penicylinowej.

Biosynteza enzymu: trwa kilkanaście godzin równolegle do narastania biomasy. Temp. poniżej 30^oC, pH=6,5 – 8. Gdy pH osiąga 8 to biosynteza jest przerywana.

Wydzielanie enzymu

Immobilizacja enzymu:

- na sephadexie przy użyciu CNBr

- na żywicy polimetakrylanowej przy użyciu aldehydu glut arowego

- na celulozie różnie preparowanej

- na kopolimerze sacharozy epichlorohydryny

- na żywicach akrylowych

- przez absorpcję na bentoicie

- na włóknach poliakrylonitrylowych

- wiązanie enzymu na amberlicie xad2 z udziałem diaminy alifatycznej użytej jako linker (łącznik), tworzy się dwustronne wiązanie amidowe linker – żywica, linker – cząsteczki enzymu.

Proces hydrolizy penicyliny G prowadzi się w dwóch typach bioreaktorów:

1. Reaktor zbiornikowy z mieszaniem, gdy enzym osadzony jest na trwałym nośniku i zawiera się w zawiesinie w roztworze reagującym.

2. Reaktor kolumnowy, gdy biokatalizator stosowany jest na żelu.

Warunki procesu:

- 8 – 10% roztwór zasady potasowej lub sodowej penicyliny G, temp. 35 – 40^oC

- czas trwania reakcji zwykle 2 – 4godz., pH=7,5 – 8

Postęp reakcji określany jest na podstawie zużycia roztworu ługu służącego do neutralizacji wydzielającego się kwasu fenylooctowego. Czas aktywności technologicznej im mobilizowanego enzymu: 600 – 14000 godzin. Z 1 kg biokatalizatora można otrzymać 200 – 2000 kg produktu w czasie 1000 – 2000 godzin pracy.

INSULINA

Insulina – polipeptyd o masie około 6 kD, który jest wytworzony przez komórki β wysepek Langerhansa. Komórki α wysepek produkują antagonistyczny glukagon.

Działanie insuliny:

Insulina wiąże się z receptorami insulinowymi na powierzchni komórek insulinowych i aktywuje procesy wnikania i przerobu glukozy. Czas półtrwania insuliny w krwioobiegu wynosi 20 minut. Wydzielanie insuliny w organizmie jest procesem ciągłym, ale poziom glukozy w organizmie w ciągu doby się waha.

Budowa chemiczna insuliny:

- składa się z dwóch łańcuchów A i B połączonych dwoma mostkami disulfidowymi

- w łańcuchu A jest 21 aminokwasów, w łańcuchu B – 30.

- na końcu jest alanina – w insulinie wieprzowej. Przy 7A i 7B i 19A i 20B są Moski łączące łańcuchy

- pętla w łańcuch A między 6 i 11 aminokwasem

- insulina tworzy dimery, tetramery, heksametry – mogą tworzyć się większe agregaty

- łańcuchy niepołączone w mieszaninie nie mają aktywności biologicznej

Historia insuliny:

1890 – praca Meringa i Minkowskiego – stwierdzenie że w krwi jest czynnik regulujący poziom cukru

1921 – młodzi lekarze wydzielili ten czynnik: Best i Banting (wyciąg z trzustki). W dwa lata po tym otrzymali nagrodę Nobla

1926 – Abel otrzymuje insulinę w stanie krystalicznym

1955 – Sanger ustala strukturę pierwszorzędową insuliny. Za metody sekwencjonowania peptydów – nagroda Nobla. Otrzymał w sumie dwa razy Nobla z dziedziny chemii.

1969 – przestrzenna struktura insuliny została odkryta

Lata 80 – odkrycie możliwości produkcji biotechnologicznej insuliny

Chemiczna metoda syntezy insuliny:

Łańcuchy bez problemu udało się zsyntezować. Problemem było dokładne połączenie łańcuchów w odpowiednich pozycjach. W końcu się to udało z użyciem peptydów sygnałowych, które później zostają wycięte.

Właściwości insuliny:

- rozpuszczalna w kwasach i zasadach

- pkt izoelektryczny przy pH=5,3, wtedy insulina wydziela się z roztworu i jest rozpuszczalna w rozcieńczonym alkoholu.

Problemem wydzielenia insuliny z trzustek zwierzęcych są enzymy trawienne (trypsyna głównie), które rozkładają insulinę. Enzymy trawienne muszą być unieczynnione działaniem HCl, dopiero po tym może nastąpić ekstrakcja etanolem. Wyodrębnienie z ekstraktu odbywa się przez wysolenie i strącenie w punkcie izoelektrycznym. Dalsze oczyszczanie odbywa się przez krystalizację.

Etapy wydzielenia insuliny:

1. Przy pH=2,5, w temp. 5^oC materiał zwierzęcy poddaje się dwukrotnej ekstrakcji etanolem. Najpierw 95%, później 65%

2. Oddzielenie zanieczyszczeń

3. Zagęszczenie

4. Oddzielenie tłuszczów i białek przez ogrzanie do temp. 35 – 50^oC i filtrację

5. Wysolenie insuliny z innymi proteinami i odfiltrowanie

6. Rozpuszczenie w wodzie

7. Doprowadzenie do pH=5,3, co powoduje ponowne strącenie insuliny

8. Filtracja (odsączenie insuliny)

9. Przemycie acetonem, eterem

10. Wysuszenie pod zmniejszonym ciśnieniem

11. Krystalizacja

Krystalizacja metodą Scotta:

Krystalizacja odbywa się z HCl 2,65%. Rozpuszcza się 75g insuliny w 3,24l tego kwasu. Doprowadza się buforem fosforanowym do pH=5,3, a następnie dodaje się 600ml acetonu, wtedy insulina krystalizuje.

Bufor: 402g Na₂HPO₄ 12H₂O + 66g KH₂PO₄ rozpuszczone w 24dm₃ wody.

Metody otrzymywania insuliny w mikroorganizmach

1. Metoda biotechnologiczno – chemiczna

Biosynteza łańcuchów w dwóch oddzielnych szczepach E. coli i łączenie ich metodami chemicznymi

1. Metoda biosyntetyczna

Wykorzystuje bakterie E. coli, do których metodą plazmidową wprowadzono gen pro insuliny ludzkiej i doprowadzono do jego ekspresji, a następnie działaniem enzymów rozkłada się pro insulinę na insulinę i peptyd C.

Uproszczony przebieg biosyntezy insuliny w komórkach bakterii E. coli

1. Semisynteza z insuliny wieprzowej

Polega na przetworzeniu insuliny wieprzowej w ludzką poprzez usunięcie końcowej alaniny (31) z łańcucha B i przyłączenie w jej miejsce treoniny. Wiązanie disulfidowe nie zostają naruszone. Tego rodzaju insulina nosi nazwę insuliny humanizowanej.

Preparat insulinowy:

- hormon (insulina)

- substancje przedłużające działanie insuliny (białka tworzące z insuliną kompleksy: protaminy np. salmina – białka uzyskiwane ze spermy łososia, zasadowe, zawierające wyłącznie alifatyczne aminokwasy argininy najczęściej. Pkt. Izoelektryczny powyżej 12)

- środki dezynfekujące (meta krezol lub fenol)

- środki wspomagające krystalizację i bufory (cynk, na jeden heksametr insuliny dodaje się dwa atomy cynku, który wspomaga krystalizację i hamuje aktywność proteazy degradującej rozpad protaminy znajdującej się w tkankach i surowicy krwi co w efekcie spowalnia wydzielanie się insuliny)

Muteiny: białkowe substancje lecznicze mające inną sekwencję aminokwasów, wytworzone metodami inżynierii genetycznej.