Laboratorium 14 F I Z Y C Z N E I C H E M I C Z N E W Ł A Ś C I W O Ś C I
K W A S Ó W N U K L E I N O W Y C H
Ćwiczenie 1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.
Do 1 mL roztworu DNA dodaj kroplę stężonego roztworu HCl. Zaobserwuj zmętnienie wynikające z wytrącenia kwasu nukleinowego. Następnie dodaj do próby kilka kropel roztworu amoniaku - kwas ulega ponownemu rozpuszczeniu. Sformułuj wnioski.
Ćwiczenie 2. Reakcje odróżniające RNA od DNA.
wykrywanie RNA - próba Biala
Do jednej probówki dodaj 1 mL roztworu RNA, a do drugiej - 1 mL roztworu DNA. Następnie do obu probówek dodaj po 1 mL roztworu FeCl3 i 0,4 mL roztworu orcyny. Probówki umieść we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Zaobserwuj różnicę w powstającej barwie między probówkami (w obecności rybozy powstaje zielone zabarwienie o natężeniu około 10 razy większym niż w obecności deoksyrybozy). Sformułuj wnioski.
wykrywanie DNA - próba Dischego
Do jednej probówki dodaj 1 mL roztworu RNA, a do drugiej - 1 mL roztworu DNA. Następnie do obu probówek dodaj po 2 mL roztworu difenyloaminy. Probówki umieść we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Zaobserwuj różnicę w powstającej barwie między probówkami (w obecności deoksyrybozy powstaje niebieskie zabarwienie). Sformułuj wnioski.
wykrywanie DNA - reakcja Feulgena
Do jednej probówki dodaj 1 mL roztworu RNA, a do drugiej - 1 mL roztworu DNA. Następnie do obu probówek dodaj po 4 krople 2 M roztworu HCl. Probówki umieść we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Następnie ostudź zawartość probówek pod bieżącą wodą. Do obu probówek dodaj po 1 mL 1 M roztworu NaOH i po 2 mL odczynnika Schiffa. Odczekaj około 10 minut. Zaobserwuj różnicę w powstającej barwie między probówkami (w obecności deoksyrybozy powstaje czerwono-fioletowe zabarwienie). Sformułuj wnioski.
Ćwiczenie 3. Jakościowa analiza DNA.
kwaśna hydroliza DNA
Do probówki dodaj 3 mL roztworu DNA oraz 3 mL 72% roztworu HClO4. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut. Uzyskany hydrolizat po ostudzeniu służy do jakościowej analizy DNA.
wykrywanie pentozy w hydrolizacie DNA
Do 1 mL hydrolizatu DNA dodaj 2 mL stężonego roztworu HCl oraz 2 krople roztworu floroglucyny. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 1 minutę. Zaobserwuj powstającą barwę i sformułuj wniosek.
wykrywanie kwasu fosforowego w hydrolizacie DNA
Zobojętnij 0,5 mL hydrolizatu DNA przy użyciu 1,5 mL roztworu amoniaku. Następnie dodaj 1 mL stężonego roztworu HNO3 i 2 mL 5% roztworu molibdenianu amonu. Zawartość probówki ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Zaobserwuj powstający osad i sformułuj wniosek.
wykrywanie puryn
Do jednej probówki dodaj 1 mL hydrolizatu DNA, a do drugiej 1 mL roztworu adeniny. Następnie do obu probówek dodaj po 2-3 krople stężonego roztworu amoniaku. Wymieszaj i do obu probówek dodaj po 4-5 kropli amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra. Zaobserwuj tworzenie się zmętnienia/osadu. Sformułuj wniosek.
Ćwiczenie 4. Jakościowa analiza RNA.
kwaśna hydroliza RNA
Do probówki dodaj 3 mL roztworu RNA oraz 3 mL 72% roztworu HClO4. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut. Uzyskany hydrolizat po ostudzeniu służy do jakościowej analizy RNA.
wykrywanie pentozy w hydrolizacie RNA
Do 1 mL hydrolizatu RNA dodaj 2 mL stężonego roztworu HCl oraz 2 krople roztworu floroglucyny. Probówkę ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 1 minutę. Zaobserwuj powstającą barwę i sformułuj wniosek.
wykrywanie kwasu fosforowego w hydrolizacie RNA
Zobojętnij 0,5 mL hydrolizatu RNA przy użyciu roztworu amoniaku (ok. 1,5 mL). Następnie dodaj 1 mL stężonego roztworu HNO3 i 2 mL 5% roztworu molibdenianu amonu. Zawartość probówki ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Zaobserwuj powstający osad i sformułuj wniosek.
wykrywanie puryn w hydrolizacie RNA
Do jednej probówki dodaj 1 mL hydrolizatu RNA, a do drugiej 1 mL roztworu adeniny. Następnie do obu probówek dodaj po 2-3 krople stężonego roztworu amoniaku. Wymieszaj i do obu probówek dodaj po 4-5 kropli amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra. Zaobserwuj tworzenie się zmętnienia/osadu. Sformułuj wniosek.
Ćwiczenie 4. Widmo absorpcyjne kwasów nukleinowych.
Zasada:
Wszystkie związki zawierające układ purynowy lub pirymidynowy pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie fal o długości 250 - 280 nm. Wynika to z obecności wiązań podwójnych i heteroatomów w pierścieniu purynowym i pirymidynowym. Dlatego dla kwasów nukleinowych oraz budujących je nukleotydów i zasad azotowych charakterystyczne są widma absorpcyjne o maksimach absorpcji w zakresie 250 - 280 nm. Ponieważ reszty cukrowa i fosforanowa nie mają większego wpływu na pochłanianie światła w tym zakresie fal, widma absorpcji nukleotydów, nukleozydów i zasad azotowych są podobne.
Wykonanie:
Dokonaj pomiaru widma absorpcji dla następujacych roztworów: adeniny, adenozyny, hipoksantyny, inozyny, ksantyny i guaniny. Pomiary należy przeprowadzić na spektrofotometrze z ciągłą rejestracją widma względem próby ślepej (H2O) w kuwetach 1-cm w zakresie fal 200 - 350 nm. Zaobserwuj przebieg widm absorpcji dla badanych roztworów. Odczytaj i zanotuj maksima i minima absorpcji dla badanych związków w badanym zakresie fal.