Laboratorium 2 B I A Ł K A
Ćwiczenie 1: Reakcja biuretowa - wykrywanie wiązania peptydowego.
odczyn biuretowy aminokwasów
Do 1 mL roztworu glicyny dodaj 1 mL 10% roztworu NaOH i 4-5 kropel 1% roztworu CuSO4.
odczyn biuretowy peptydu i białka
Do osobnych probówek wlej po 1 mL roztworów: glicylo-glicyny, insuliny i białka. Następnie do każdej probówki dodaj po 1 mL 10% roztworu NaOH i 4-5 kropel 1% roztworu CuSO4.
odczyn biuretowy biuretu (dwumocznika)
Nad małym płomieniem gazowym ogrzewaj w suchej probówce kilka kryształów mocznika, aż do ich stopienia. Stopiony mocznik po pewnym czasie krzepnie. Po ostudzeniu probówki otrzymany biuret rozpuść w 1 mL 10% NaOH i dodaj 4-5 kropel 1% roztworu CuSO4.
Zanotuj barwę powstałą w wyniku przeprowadzenia kolejnych doświadczeń. Wyniki zestaw w tabeli i sformułuj wnioski.
Uwaga: Reakcja biuretowa jest dodatnia, jeśli pojawia się czerwono-fiołkowe zabarwienie (unikaj nadmiaru CuSO4, gdyż niebieska barwa odczynnika biuretowego maskuje właściwą barwę odczynu).
Ćwiczenie 2: Denaturacja białek.
Denaturacja cieplna białek
Do probówki dodaj 2 mL roztworu białka i ogrzej we wrzącej łaźni wodnej do wrzenia.
Denaturacja białek stężonym kwasem azotowym (V) - próba Hellera
Do probówki odmierz 2 mL stężonego HNO3 i ostrożnie po ściankach probówki dodawaj roztwór białka. Na granicy warstw powstaje pierścień zdenaturowanego białka.
Strącanie białek przy użyciu etanolu
Do dwóch probówek zawierających po 2 ml 96% roztworu alkoholu etylowego dodaj po 0,5 mL roztworu białka. Do pierwszej probówki natychmiast dodaj 10 mL wody destylowanej i dokładnie wymieszaj. Drugą probówkę odstaw na 2 godz. i dopiero po tym czasie dodaj do tej probówki 10 mL wody destylowanej i dokładnie wymieszaj. Porównaj wyniki uzyskane w każdej z probówek i sformułuj wniosek.
Denaturacja białek za pomocą kationów metali ciężkich
Przygotuj dwie probówki zawierające po 2 mL roztworu białka. Do pierwszej dodaj kilka kropel 1% roztworu Pb(CH3COO)2, a do drugiej kilka kropel 0,1 M roztworu AgNO3. Zanotuj wyniki.
Denaturacja białek za pomocą anionów kwasów organicznych
Przygotuj dwie probówki zawierające po 1 mL roztworu białka. Do pierwszej dodaj 1 mL 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego (TCA), a do drugiej 3 krople 1 M roztworu kwasu octowego i 1 mL nasyconego roztworu kwasu pikrynowego. Zapisz wyniki i sformułuj wnioski.
Uwaga: O dodatnim wyniku reakcji świadczy wytrącający się osad, zmętnienie lub powstający biały pierścień.
Ćwiczenie 3: Amfoteryczne właściwości białek.
Do dwóch probówek odmierz po 5 mL wody destylowanej i po 5 kropel błękitu tymolowego. Do jednej probówki dodaj 3 krople 0,01 M NaOH do powstania zabarwienia lekko niebieskiego (pH 9,6), a do drugiej 5 kropli 0,5 M roztworu HCl do powstania zabarwienia lekko czerwonego (pH 1,3). Unikaj nadmiaru odczynników. Następnie do obu probówek wkraplaj powoli 1% roztwór żelatyny do momentu aż roztwór stanie się żółty (pH 2,8 - 8,0). Sformułuj wnioski.
Ćwiczenie 4: Zastosowanie wysalania do frakcjonowania białek.
Oddzielanie albumin od globulin przy użyciu (NH4)2SO4
Do 2 mL surowicy dodaj 2 mL 0,9% NaCl i 4 mL nasyconego roztworu (NH4)2SO4. Po zmieszaniu uzyskuje się półnasycony roztwór (NH4)2SO4. Wypadający roztwór globulin odwiruj przy 3000 obrotów / minutę przez 15 min. Po wirowaniu ostrożnie zlej supernatant. Do nowej probówki odmierz ok. 0,5 mL supernatantu i wykonaj reakcję biuretową. Do pozostałego supernatantu dodawaj (NH4)2SO4 w stanie stałym aż do nasycenia roztworu. Wytrącają się albuminy.
Oddzielanie albumin od globulin przy użyciu MgSO4 i (NH4)2SO4
Do 2 ml surowicy dodaj 2 ml 0,9% NaCl i i taką ilość MgSO4 w stanie stałym, aby otrzymać roztwór nasycony. Wypadający roztwór globulin odwiruj przy 3000 obrotów / minutę przez 15 min. Po wirowaniu ostrożnie zlej supernatant. Do nowej probówki odmierz ok. 0,5 mL supernatantu i wykonaj reakcję biuretową. Do pozostałego supernatantu dodawaj (NH4)2SO4 w stanie stałym aż do nasycenia roztworu. Wytrącają się albuminy.