Ramięga Tomasz Data wykonania: 22.10.08

Kopciara Marcin ŚRODA

Świątczak Piotr godz. 15¹⁵-19⁰⁰

BIOTECHNOLOGIA ŚRODOWISKA

LABORATORIUM

ĆWICZENIE NR 3

„BIODEGRADACJA BIAŁEK”

Wstęp:

Odpady białkowe z przemysłu stanowią spory problem dla ich wytwórców. Białka z przemysłu mleczarskiego czy ubojni mogą być degradowane do niskocząsteczkowych peptydów czy aminokwasów na drodze różnych reakcji chemicznych jak hydroliza kwasowa wymagająca dużych nakładów energii i odczynników lub za pomocą metod ekologicznych. Tu z pomocą przychodzą człowiekowi drobnoustroje. Wytwarzane przez nie hydrolazy peptydowe rozszczepiają wiązania peptydowe (występujące między aminokwasami, łączy grupę α-aminową jednego aminokwasu z grupą α-karboksylową drugiego aminokwasu) rozkładając białko do mniejszych podjednostek. W wielu krajach na świecie stosuje się podczyszczanie takich ścieków z przemysłu metodą osadu czynnego, w którym bytują mikroorganizmy żywiące się zanieczyszczeniami. Jest to tani i bardzo efektywny sposób utylizacji tych odpadów. W wypadku gdy ścieki zawierają duże ilości białka (np., kazeiny i hemoglobiny) ważne jest by w osadzie bytowały drobnoustroje wytwarzające enzymy o dużym powinowactwie do tych zanieczyszczeń.

W oznaczeniach będziemy używać proteinazy serynowej Bacillusi subtilis . Jest to enzym o bardzo szerokiej specyficzności substratowej co sprawia, że można go zastosować do degradacji zróżnicowanych zanieczyszczeń białkowych.

Wykonanie oznaczenia:

Wykonane przez nas ćwiczenie miało na celu wyznaczenie dynamiki reakcji hydrolizy kazeiny zawartej w ściekach z mleczarni i hemoglobiny zawartej w ściekach z zakładu mięsnego.

Nasza grupa zajmowała się ściekami z mleczarni, czyli oznaczaliśmy prędkość rozkładu kazeiny.

Do kolby stożkowej dodaliśmy 20ml ścieków mleczarskich o pH początkowym 9.0 skorygowanym za pomocą 0.05 N NaOH i umieściliśmy ją w łaźni wodnej o temperaturze 37ºC. Po 3 min. do kolbki dodaliśmy 1ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu proteolitycznego- proteinazy serynowej Bacillus subtilis. Po 0, 15, 30, 45 minutach od momentu dodania enzymu pobieraliśmy po 1ml mieszaniny reakcyjnej celem oznaczenia z odczynnikiem Folina.

Wykonanie oznaczenia z odczynnikiem Folina:

Proteinaza serynowa - subtylizyna uwalnia z kazeiny mleka krótkie peptydy, rozpuszczalne w roztworze kwasu trójchlorooctowego, które oznacza się ilościowo w reakcji z odczynnikiem Folina.

Do 1ml mieszaniny reakcyjnej pobranej wcześniej w odpowiednim czasie dodaliśmy 2ml 5% roztworu CCL₃COOH, służącego do odbiałczenia roztworu. Dokładnie wymieszaliśmy i pozostawiliśmy na 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym przesączyliśmy przez sączki z bibuły. Pobraliśmy 1ml klarownego przesączu i dodaliśmy 2ml 0.6 N NaOH oraz 0.6ml odczynnika Folina (1:2), całość wymieszaliśmy. Po 10 minutach oznaczyliśmy absorbancję przy długości fali 690nm wobec próby, która zawierała 1ml wody zamiast badanej mieszaniny reakcyjnej. Wyniki umieściliśmy w tabeli poniżej.

Tabela 1. Wyniki pomiarów

Czas inkubacji [min]	Ścieki [ΔE]
		ubojnia		mleczarnia
	0	0,27	0,19	0,15	0,12
		0,34	0,22	0,01	0,05
	15	0,62	0,69	0,28	0,25
		0,71	0,64	0,20	0,17
	30	1,00	1,10	0,30	0,29
		1,05	1,05	0,28	0,25
	45	1,25	1,50	0,42	0,40
		1,4	1,70	0,35	0,35

Tabela 2. Wyniki uśrednione, z których wykonano wykres (wyniki po odrzuceniu skrajnych wartości)

Czas inkubacji [min]	Ścieki [ΔE]
		ubojnia	mleczarnia
0	0,26	0,09
15	0,69	0,21
30	1,05	0,29
45	1,38	0,37

Obliczenia:

Z wyników otrzymanych powyżej obliczamy wartości ΔE₆₉₀ potrzebne do utworzenia wykresu obrazującego kinetykę reakcji. Obliczamy ze wzoru:

Gdzie:

oznacza absorbancję po czasie n minut

oznacza absorbancję na początku procesu

Wyniki obliczeń wykonanych w arkuszu zamieszczam w tabeli 3.

Tabela 3. Wyniki do wykresu zależności ΔE₆₉₀ od czasu.

Czas inkubacji [min]	ΔE690
		ubojnia	mleczarnia
15	0,44	0,12
30	0,80	0,21
45	1,13	0,28

Wykres obrazujący kinetykę reakcji:

Wnioski:

Z wykresu wynika, że użyty do oznaczeń preparat enzymatyczny wykazuje większe powinowactwo do hemoglobiny niż kazeiny. Wykresy wskazują na stały przyrost produktów hydrolizy w czasie wykonywania oznaczeń.

---