Marcin Kopciara

Tomasz Ramięga

Piotr Świątczak

Ćwiczenie 2

SKRINING DROBNOUSTROJÓW O RÓŻNORODNYCH UZDOLNIENIACH ENZYMATYCZNYCH

Wstęp teoretyczny:

Aby odnaleźć mikroorganizmy posiadające zdolność do wytwarzania określonych metabolitów stosuje się szereg zabiegów określanych jako skrining (z ang. screening). Szczepów można poszukiwać w każdym naturalnym środowisku drobnoustrojów: w glebie, wodzie, powietrzu, owocach, ściekach przemysłowych.

Najczęściej stosowaną metodą izolacji bakterii jest wysiew odpowiedniego materiału na płytki agarowe, a następnie selekcja na podstawie kryteriów odpowiednio dobranych do kierunku poszukiwań. Wprowadzenie do pożywki odpowiednich składników (źródło węgla, azotu, energii, pH, itp.) stwarza określone warunki umożliwiające stymulację wzrostu żądanych mikroorganizmów przy jednoczesnym zahamowaniu wzrostu innych.

Zaszczepienie takiej pożywki mieszaną populacją drobnoustrojów powoduje, że rozwija się w niej gatunek najlepiej przystosowany.

W celu dokonania oceny przydatności biotechnologicznej drobnoustrojów należy je, po wyizolowaniu i namnożeniu testować w postaci czystych kultur.

Zabiegi skriningowe mogą być usprawnione dzięki użyciu odpowiednich wskaźników lub substratów w podłożach powodujących wokół kolonii barwnych stref, świadczących o aktywności metabolicznej badanych szczepów. Przykładowo szczepy wytwarzające enzymy amylolityczne można różnicować na podłożu z dodatkiem skrobi. Po zalaniu płytki roztworem jodu pojawiają się wokół kolonii jasne strefy na granatowym tle.

Na tej podstawie można obliczyć wskaźnik aktywności szczepu:

wskaźnik aktywności = średnica strefy przejaśnienia / średnica kolonii

Skrining dzielimy na :

1. Skrining losowy

2. Skrining racjonalny - hodowla w warunkach odpowiednich dla jednego szczepu

Wykonanie ćwiczenia:

1. Izolowanie drobnoustrojów bytujących w glebie

Odważyliśmy 25 g próbkę gleby i przenieśliśmy do 250 ml jaowej soli fizjologicznej ( rozcieńczenie 10x). Następnie wytrząsaliśmy zawiesinę przez ok. 15 minut i pozostawiliśmy do opadnięcia większych cząstek.

Wykonaliśmy rozcieńczenia : 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 - 1 ml zawiesiny gleby przenosiliśmy do kolejnych probówek i uzupełnialiśmy wodą destylowaną w ilości 0,9 ml.

Z dwóch ostatnich rozcieńczeń pobraliśmy po 0,1 ml próbki na podłoża Sabourand (pleśnie, drożdże) oraz na podłoża z bulionem (bakterie).

Płytki były inkubowane w temperaturze 28-30°C przez 7 dni. Po inkubacji policzyliśmy wyrosłe kolonie.

Podłoże	Rozcieńczenie	Ilość kolonii	Opis kolonii
Sabourand	10^-5	9	pleśń o szarym zabarwieniu
Sabourand	10^-6	3	pleśń o szarym zabarwieniu
Bulion	10^-5	14	różnej wielkości kolonie
Bulion	10^-6	4	różne zabarwienie(szare, kremowe), jedna z kolonii większa

Po policzeniu kolonii obliczyliśmy ilość mikroorganizmów w 1 g gleby:

Pleśnie, drożdże:

Uśredniliśmy ilość grzybów w 0,1 ml próbki:

30 * 10⁵ + 9 * 10⁵ = 39 * 10⁵ / 2 = 19,5 * 10⁵

Więc w 250 ml próbki i na 1g gleby:

19,5 * 10⁵ * 250 ml / 0,1 ml * 25 = 19,5 * 10⁷ jtk/g_gleby

Bakterie:

Uśredniliśmy ilość bakterii w 0,1 ml próbki:

40 * 10⁵ + 14 * 10⁵ = 54 * 10⁵ / 2 = 27 * 10⁵

Więc w 250 ml próbki i na 1g gleby:

27 * 10⁵ * 250 ml / 0,1 ml * 25 = 27 * 10⁷ jtk/g_gleby

2. Obserwacje makroskopowe posiewów na podłożach ze specyficznymi wskaźnikami

Proteolityczna aktywność bakterii Bacillus subtilis

Do hodowli tych bakterii zastosowano podłoże z kazeiną (białkiem mleka).

Wokół kolonii wyrosłych na płytkach widoczne są rozjaśnienia - jasne strefy wokół kolonii. Świadczy to o aktywnośi proteolitycznej badanych bakterii.

Z płytki przesialiśmy na skos agarowy z bulionem jedną z kolonii wykazującą aktywność proteolityczną.

Na skosie wyrosła kolonia o kremowym zabarwieniu.

Amylolityczna aktywność bakterii Bacillus licheniformis

Do hodowli tych bakterii zastosowano podłoże ze skrobią.

Aby ocenić aktywność amylolityczną zalaliśmy płytkę płynem Lugola.

Po kilku minutach zaobserwowaliśmy wokół kolonii strefy rozjaśnień na granatowym tle. Świadczą one o aktywności amylolitycznej badanych bakterii.

Z płytki przesialiśmy na skos agarowy z bulionem jedną z kolonii wykazującą aktywność amylolityczną.

Na skosie wyrosła kolonia o białym zabarwieniu.

Lipolityczna aktywność pleśni Mucor circinelloides

Do hodowli tej pleśni zastosowano podłoże z trimaślanem.

Wokół kolonii wyrosłych na płytkach widoczne są rozjaśnienia - jasne strefy wokół kolonii. Świadczy to o aktywnośi lipolitycznej badanej pleśni.

Z płytki przesialiśmy na skos agarowy z podłożem Sabourand jedną z kolonii (największą) wykazującą aktywność lipolityczną.

Na skosie wyrosł najprawdopodobniej inny gatunek pleśni. Jest to spowodowane tym, że nie udało się pobrać biomasy na ezę podczas szczepienia (eza nie była zwilżona).

---