Ramięga Tomasz Data wykonania: 19,11,2008 rok

Kopciara Marcin ŚRODA

Świątczak Piotr godz. 15¹⁵-19⁰⁰

BIOTECHNOLOGIA ŚRODOWISKA

LABORATORIUM

ĆWICZENIE NR 6

„IMMOBILIZOWANE BIOKATALIZATORY”

1. Wstęp teoretyczny:

Biokatalizatory są to substancje wytwarzane przez żywe organizmy, regulujące przebieg procesów biologicznych, tzn. wpływające na ich przyspieszenie bądź spowolnienie, a także decydujące o rodzaju przemian, jakim może ulec substancja wyjściowa. Mogą to być enzymy, kompleksy enzymów, organelle komórkowe i całe komórki bądź ich różne kombinacje.

Enzymy są białkami o swoistej budowie, które wykazują zdolność do katalizowania reakcji chemicznych w przyrodzie. Nazywane są również biokatalizatorami. Ich zadaniem jest zwielokrotnienie szybkości przebiegu katalizy enzymatycznej poprzez zmniejszenie energii aktywacji substratu z zachowaniem końcowego stanu równowagi. W teorii enzym nie ulega zużyciu w trakcie przebiegu procesu a jego aktywność pozostaje bez zmian jednak w praktyce zauważa się niewielkie spadki aktywności. Schemat takiej reakcji można zapisać w następujący sposób:

Enzym (E) łącząc się z substratem (S) tworząc kompleks (ES), który jest przekształcany w kompleks enzymu z produktem (EP), który następnie ulega rozpadowi. Otrzymujemy w ten sposób gotowy produkt (P) i enzym (E) w formie wyjściowej.

Immobilizowanymi biokatalizatorami nazywamy takie biokatalizatory, które posiadają formę zapewniającą ich wielokrotne stosowanie.

Immobilizacja (łac. immobilis - nieruchomy) to zjawisko powszechnie występujące w przyrodzie. Wiele procesów enzymatycznych przebiega przy udziale enzymów i komórek związanych w naturalny sposób z rozpuszczalnymi lub nierozpuszczalnymi matrycami oraz nośnikami mechanicznymi.

Pierwszą technologią, w której zastosowano złoże unieruchomionego biokatalizatora jest produkcja kwasu octowego przez komórki bakterii Acetobacter aceti zaadsorbowane na wiórach bukowych. Złoża biologiczne z unieruchomioną biomasą wykorzystuje się również w technologii oczyszczania ścieków. Unieruchomione enzymy i komórki są obecnie coraz częściej stosowane w przemyśle chemicznym, farmaceutycznym i spożywczym. Immobilizowane biokatalizatory stosowane są również w ochronie środowiska naturalnego, do degradacji zanieczyszczeń.

Otrzymywanie immobilizowanych biokatalizatorów zawierających całe komórki drobnoustrojów jako źródło enzymów daje możliwość pominięcia kosztownych i pracochłonnych procesów izolacji i oczyszczania białek enzymatycznych.

Klasyczne metody unieruchamiania biokatalizatorów polegają na ich wiązaniu wewnątrz lub na powierzchni nośników nierozpuszczalnych. Do metod tych należą:

1. Wiązanie na powierzchni nośnika:

• Adsorpcja - adhezja na nieorganicznych (szkła porowate, tlenki metali) i organicznych (pochodne

celulozy, chityny, polimery) nośnikach. Metoda najprostsza i najtańsza, ale nie zapewniająca trwałego związania enzymu.

• Wiązanie kowalencyjne - biokatalizatora z powierzchnią nośnika przez utworzenie wiązań, np. peptydowych przy zastosowaniu różnych odczynników aktywujących i wiążących.

2. Wiązanie w matrycy nośnika:

Pułapkowanie - w żelach naturalnych (alginian, celuloza, agar, agaroza, żelatyna, kolagen) lub syntetycznych (poliuretan, żywice epoksydowe). Metoda polega na zmieszaniu biokatalizatora z monomerem lub rozpuszczalnym polimerem o przeprowadzeniu procesu polimeryzacji lub usieciowienia w celu utwardzenia żelu w postaci membran, kuleczek lub włókien.

3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych (nylonowych, celulozowych, liposomalnych) przez:

kapsułkowanie lub mikrokapsułkowanie, pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych z odpowiednich polimerów syntetycznych.

4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego przez:

kopolimeryzację enzymów lub komórek drobnoustrojów z nośnikiem rozpuszczalnym

2. Cele ćwiczenia:

• Poznanie metody immobilizacji drobnoustrojów w alginianie wapnia.

• Sprawdzenie stabilności matrycy alginianowej w różnych środowiskach.

• Określenie efektywności działania immobilizowanej β-fruktofuranozydazy (w żelu alkohol poliwinylowy (PVA) - alginian) w reakcji hydrolizy sacharozy.

3. Wykonanie oznaczeń:

3.1 Immobilizacja drobnoustrojów metodą Pułapkowanie w alginianie wapnia

3.1.1 Opis metody

10 ml zawiesiny zawierającej komórki drożdży piekarskich przenieśliśmy do zlewki zawierającej taką samą ilość 3% roztworu alginian wapnia. Po starannym wymieszaniu, unikając spienienia, wkropliliśmy ten roztwór strzykawką, zaopatrzoną w cienką igłę, do zlewki zawierającej zimny roztwór CaCL₂, mieszając podczas całego procesu wkraplania. Następnie pozostawiliśmy w ten sposób utworzone „kulki” w środowisku zimnego chlorku wapnia na 30 min. Po tym czasie przepłukaliśmy je wodą destylowaną o temperaturze pokojowej i umieściliśmy po 4 kulki w czterech różnych środowiskach na 30 minut od czasu do czasu intensywnie mieszając. Po tym czasie oceniliśmy wygląd roztworów i po wyjęciu z nich kulek poddaliśmy je testowi na wytrzymałość.

3.1.2 Wyniki / Obserwacje / Wnioski

Środowisko	Obserwacje makroskopowe roztworów	Obserwacje na podstawie testu na wytrzymałość	Wnioski
Fosforan	Pojawiły się widoczne, luźno pływające białe kłaczki	Kulki są bardzo miękkie	Pojawiające się kłaczki to fosforan wapnia. Degradacja matrycy z czasem doprowadzi do uwolnienia się komórek drożdży.
EDTA	Nie zaobserwowałem żadnych zmian	Kulki są miękkie ale zachowują kształt	Kulki są miękkie. Wynika to z ubytku w matrycy jonów wapnia skompleksowanych przez EDTA.
Sól fizjologiczna	Nie zaobserwowałem żadnych zmian	Kulki są twarde, śliskie, elastyczne, twardsze niż u EDTA	Ponieważ w czasie trwania eksperymentu nie zaszły żadne zmiany to możemy podejrzewać iż jest to potencjalnie dobre środowisko do przechowywania enzymu im mobilizowanego na alginianie wapnia. Jest to spowodowane tym iż w środowisku występują jony wapnia utrudniające rozpuszczanie się matrycy
cytrynian	Nastąpiło zmętnienie cieczy, kulki prawie się rozpuściły	Pozostałość po kulkach jest mazista, bez konsystencji	Opalizująca zawiesina to komórki drożdży. Kwasy organiczne rozpuszczają alginian wapnia co wyklucz go z grona potencjalnych środowisk do przechowywania w ten sposób immobilizowanych enzymów. Jednak jest to dobra metoda rozpuszczania matrycy alginianowej.

3.2 Zastosowanie immobilizowanej β-fruktofuranozydazy do hydrolizy sacharozy

3.2.1 Opis metody

3.2.1.1

Do 10 ml substratu, którym jest 3% roztwór sacharozy dodaliśmy 5 kulek (o łącznej masie 105 mg) immobilizowanej w żelu PVA-alginian β-fruktofuranozydazy. Całość umieściliśmy w szczelnie zamkniętej buteleczce i poddaliśmy inkubacji w temperaturze 40^oC w czasie 30 min. w łaźni wodnej z mechanizmem wstrząsającym. Następnie zlaliśmy znad kuleczek część cieczy (ok. 2 ml), która posłużyła nam do oznaczenia stężenia cukrów redukujących w hydrolizatach skrobiowych. Stosowaną metodą była metoda Samogoy-Nelsona. Jednocześnie wykonaliśmy próbę materiałową, którą wykonuje się analogicznie do próby badanej lecz nie dodaje się preparatu.

3.2.1.2 Oznaczenie metodą Samogoy-Nelsona.

Po uprzednim rozcieńczeniu pięciokrotnym próbek (materiałowa, badana i odczynnikowa zawierająca 1ml wody zamiast preparatu) pobraliśmy po 1 ml do probówek i dodaliśmy po 1 ml odczynnika miedziowego do każdej. Następnie wstawiliśmy te trzy probówki na dokładnie 10 min. do wrzącej łaźni wodnej. Następnie wyjęliśmy je, schłodziliśmy i dodaliśmy do każdej po 1 ml odczynnika Nelsona. Po wymieszaniu i odgazowaniu (ok. 10 min.) Oznaczyliśmy absorbancję wobec próby odczynnikowej przy długości fali 520 nm.

3.2.2 Tabela zbiorcza wyników pomiarów

Preparat	Masa biokatalizatora mB [g]	Cinwertazy w żelu [^µg/g]	Objętość substratu [ml]	Czas reakcji [min]	A520	A520 (wartość średnia)	R
1	0,091	40	10	30	0,20	0,21	5
												0,22
					2			0,105	45	10	30	0,24	0,25	5
												0,26
					3			0,039	52	10	30	0,36	0,30	5
												0,24
												0,32
												0,27
Próba materiałowa (roztwór sacharozy)					0,23			0,23	1
										0,23

3.2.3 Krzywa wzorcowa

3.2.3.1 Dane do krzywej wzorcowej

Cglukozy [^µmolach/ml­]	A520
0,0125	0,03
0,025	0,105
0,05	0,155
0,1	0,32
0,15	0,46
0,2	0,57
0,25	0,68
0,3	0,78
0,35	0,86
0,4	0,9

3.2.3.2 Krzywa wzorcowa

3.2.4 Obliczenia

3.2.4.1 Stężenie cukrów redukujących

Obliczamy ze wzoru:

Gdzie : C_w stężenie cukrów redukujących

K współczynnik obliczeniowy wyznaczony z krzywej wzorcowej

zmierzona absorbancję

R rozcieńczenie próby

Obliczenia K z krzywej wzorcowej

Skoro tgα = 2,527

To ctgα = 2,527^-1 = 0,396

Gdzie: C_w2 dla preparatu drugiego

3.2.5 ZADANIE

3.2.5.1 Obliczenie aktywności preparatu na 1g immobilizowanego biokatalizatora ze wzoru

Gdzie: C_w2 stężenie cukrów redukujących

C_M stężenie cukrów redukujących w próbie materiałowej

m_B masa biokatalizatora [g]

V objętość próby [ml]

t czas reakcji [min]

3.2.5.2 Obliczenie Aktywności preparatów na 1g białka zawartego w immobilizowanym preparacie inwertazy.

C_inwertazy w 1g żelu 40 µg

Stosowane na zajęciach Immobilizowane preparaty zawierają inwertazę drożdżową (β-fruktofuranozydazę). Zawiera ona w 1g handlowego preparatu rozpuszczalnej inwertazy 0,264g białka:

0,264_białka - 1g _inwertazy

X - 45 µg

X = 0,264 x 45 x 10^-6 = 1,188 x 10^-5 g_białka

Aktywność preparatu 2 w przeliczeniu na 1g białka

3.2.5 Tabela zbiorcza wyników dla preparatu 2

Preparat	Aktywność w przeliczeniu na
		1g im mobilizowanego biokatalizatora	1g białka zawartego w immobilizowanym preparacie inwertazy
2

1

C_glukozy [^µmolach/_ml­]

A₅₂₀

---